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1、,1,第三章 细胞生物学研究方法,第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞组分的分析方法 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术,3/4/12,细胞生物学-研究方法,2,第一节 细胞形态结构的观察方法,一、光学显微镜技术 二、电子显微镜技术 三、扫描隧道显微镜,3/4/12,细胞生物学-研究方法,3,一、光学显微镜技术,3/4/12,细胞生物学-研究方法,4,光学放大系统，为两组玻璃透镜：目镜与物镜；照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片以控制光的波长范围；机械和支架系统，主要是保证光学系统的准确配制和灵活调控;对任何显微镜来说，最重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。,3
2、/4/12,细胞生物学-研究方法,（一）普通复式光学显微镜技术,5,分辨率(resolving power):指区分开两个质点间的最小距离。这个距离越小分辨本领越高。人眼的分辨力约为100-200m。显微镜分辨率的大小取决于光源波长，物镜镜口角（标本在光轴的一点对物镜镜口的张角）和介质折射率N;它们之间的关系是：D0.61/N.sin通常最大值可达140，空气中N1，最短的可见光波长450 nm，此时分辨率D292 nm，约0.3um。若在油镜下，N可达1.5，D则可达0.2um，所以普通光镜的最大分辨率是0.2 um。由于N.sin往往是一定值，要提高分辨力只有采用缩短波长的途径。,3/4/
3、12,细胞生物学-研究方法,7,普通光镜样品的制备：样品经过固定剂（如甲醛等）固定后，包埋到包埋剂（如石蜡等）中，然后切成厚约5um的薄切片。样品在观察前一般要经过染色，不同的染料对某种细胞组分有特异的吸附，如伊红和美蓝能特异性地与不同蛋白质结合，而品红则能特异性地显示出DNA的所在部位。这样便能形成足够的反差或产生不同波长的光谱以区分该种细胞组分。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,8,相差显微镜技术和微分干涉显微镜,3/4/12,细胞生物学-研究方法,（四）相差显微镜技术,光线通过不同密度的物质时，其滞留程度也不同。密度大则光的滞留时间长，密度小则滞留时间短。相差显微镜（phasecon
4、trast microscope）可将这种滞留时间之差，即光程差或相位差，转换成振幅差。相差显微镜的物镜后装有一块“相差板”，偏转（有光程差）的光线分别通过相差板的不同区域，由于相差板上部分区域有吸光物质，所以又使两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。,在光学显微镜的发展过程中，相差镜检术的发明成功，是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道，人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度），对于无色通明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本。相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，也就是有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的
5、相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察，因此相差镜检法广泛应用于倒置显微镜。,微分干涉显微镜（differential-interference microscope）可增加样品反差并且具有很强的立体感。微分干涉显微镜更适于研究活细胞中较大的细胞器。将微分干涉显微镜接上录像机，可以观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。,10,3/4/12,细胞生物学-研究方法,11,（二）荧光显微镜技术,荧光显微镜技术是以紫外线为光源，使被检物发出荧光然后在显微镜下观察其形状极其所在位置的镜检术。因使用紫外线，波长大大缩短，固可提高分辨力。荧光显微镜技术包括免疫
6、荧光技术和荧光素直接标记技术。例如将标记荧光素的纯化肌动蛋白显微注射人培养细胞中，可以看到肌动蛋白分子装配成肌动蛋自纤维。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,荧光光源般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片(一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片)，仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免
7、于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。,12,（三）激光共焦点扫描显微镜技术,普通荧光显微镜下，许多来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率降低：激光共焦点扫描显微镜（1aser scanning confocal microscopy）大大减少了这种焦平面以外的光，它在某一瞬间只用很小一部分光照明，这一束光通过检测器前的一个小孔或裂缝后成像，保证只有来自该焦平面的光成像，而来自焦平面以外的散射光则被小孔或裂缝挡住。激光共焦点扫描显微镜成像异常清晰，分辨率可以比普通荧光显微镜的分辨率提高1.41.7倍。,3/4/12,细胞生物学
8、-研究方法,13,激光共焦点扫描显微镜可自动改变观察的焦平面，而且纵向分辨率（axial resolution）得到改善，所以可以通过“光学切片”观察较厚样品的内部结构。将改变焦点获得一系列细胞不同切面上的图像，经叠加后便可重构出样品的三维结构。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,17,二、电子显微镜技术,（）电子显微镜的基本知识 电子显微镜在基本原理上与光学显微镜完全不同，构造也要比光学显微镜复杂得多，但其光路图却十分相近1电子显微镜与光学显微镜的基本区别 使用了波长比可见光短得多的电子束作为光源，波长一般小于0.1 nm。由于光源的不同，又决定了电镜与光镜的一系列不同点：用电磁透镜聚焦；
9、电镜镜筒中要求高真空；图像需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。它们的基本区别见表。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,2电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数人眼的分辨率一般为0.2 mm，光学显微镜的分辨率约为0.2um，其放大倍数为0.2 mm0.2um，即1000倍。电子显微镜的分辨率可达0.2 nm,其放大倍数为106倍。此放大倍数称为有效放大倍数；如继续用光学手段放大也不会得到任何有意义的信息，因此称之为“空放大”。,20,3透射电子显微镜的基本构造电子束照明系统：包括电子枪、聚光镜。由高频电流加热钨丝发出电子，经高电压使电子加速，经过聚光镜汇聚成电子束；成像系统：包括物镜、中间镜与投影
10、镜等。它们是若干精密加工的中空圆柱体，里面装置线圈，通过改变线圈的电流大小，调节圆柱体空间的磁场强度。电子束经过磁场时发生螺旋式运动，最终的结果如同光线通过玻璃透镜时一样，聚焦成像；真空系统：用两级真空泵不断抽气，保持电子枪、镜筒及记录系统内的高真空；记录系统：电子成像须通过荧光屏显示用于观察，或用感光胶片记录下来。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,21,（二）主要电镜制样技术介绍,1超薄切片技术由于电子束的穿透能力有限，为获得较高分辨率，切片厚度一般仅为4050nm，即一个直径为20 um的细胞可切成几百片，故称超薄切片。超薄切片要求样品既要有一定刚性又要有一定韧性，而生物样品并不具备这
11、些特性。为此，样品往往需要包埋在特殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的结构；所以超薄切片样品制备的第一步就是样品的固定，以便更好地保持细胞的精细结构。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,22,（1）固定：不仅要求保持样品的形态结构不发生改变，有时甚至要求在超微和分子水平上使细胞内部的结构和组分保持在原来的位置上，同时尽量保持原来的性质，如抗原性等。超薄切片常用的固定剂为锇酸（OsO4）和戊二醛等（表32）。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,23,（2）包埋：使样品中各种细微结构在切片过程中都得到均匀良好的支撑；使切成的超薄切片仍能保持连续完整并且有足够的强度；能耐受干燥以及观察时的电子轰
12、击、高温和真空挥发。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,包埋剂应达到如下要求：在高倍放大时不显示其本身结构；在聚合时不发生明显的收缩，以防止样品中细微结构的损坏和移位；具有良好的机械性能（如刚性和韧性等）以利于切片；易被电子穿透等。目前常用的包埋剂是环氧树脂。,25,（3）切片超薄切片过程如图35所示。切片厚度通常是4050 nm。切片刀以玻璃或钻石为材料，最常用的是玻璃刀。切片须捞在覆有支持膜（如透明塑胶膜）的载网（铜网或镍网）上才能在电镜下观察。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,26,（4）染色电镜样品仅用重金属盐进行染色以形成明暗反差，因此，只能通过电子束振幅的改变观察到黑白图像。
13、它不能像光镜切片染色可获得彩色图像。图36即是超薄切片技术显示的典型动物细胞的超微结构。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,27,AP:appressorium I S:infection sac SH:subcuticular hyphae,V.nashicola infection behavior in pectin layers in scab-inoculated leaves,3/4/12,细胞生物学-研究方法,31,5.扫描电镜技术（scanning electron microscope，SEM）,扫描电镜的电子枪发射出的电子束被电磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进
14、行“扫描”，电子束可激发样品表面放出二次电子（同时也有一些其他信号）。二次电子产生的多少与样品表面的形貌有关。二次电子由探测器收集，并在那里被闪烁器转变成光信号，再经光电倍增管和放大器又转变成电压信号来控制荧光屏上电子束的强度。这样，样品不同部位上产生二次电子多或少的差异，直接反映在荧光屏相应部位亮或暗的差别，从而得到一幅放大的立体感很强的图像（图310）。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,32,3/4/12,细胞生物学-研究方法,33,3/4/12,细胞生物学-研究方法,35,第二节 细胞组分的分析方法,一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类
15、与脂质等的显示方法 三、特异蛋白抗原的定位与定性 四、细胞内特异核酸序列的定位与定性 五、利用放射性标记技术研究生物大分子在细胞内的合成动态 六、定量细胞化学分析技术,3/4/12,细胞生物学-研究方法,36,一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物,用低渗、超声破碎或研磨等方法可使细胞膜破损，形成细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器和细胞组分的混合匀浆。差速离心（differentia1 centrifugation），即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,37,密度梯度离心是将要分离的细胞
16、组分小心地铺放在含有密度逐渐增加的、形成密度梯度的、高溶解性的惰性物质（如蔗糖）溶液的表面。在这种条件下进行离心，不同组分以不同的沉降速率沉降，形成不同的沉降带。各颗粒、组分的沉降速率与它们的形状和大小有关，通常以沉降系数（S值）表示。差速离心与密度梯度离心相结合可以达到更精细的分离（图311）。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,38,二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法(细胞化学的显示方法),利用一些显色剂与被检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。例如福尔根（Feulgen）反应可以特异显示DNA的分
17、布;PAS反应则可确定多糖的存在;四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，苏丹III可使脂滴着色（深红色）。四氧化锇和苏丹III可以证明脂肪滴的存在。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,39,米伦（Millon）反应中，氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的酪氨酸残基反应，形成红色沉淀。AgNO3可特异地显示rDNA的存在；在进行细胞中某种酶的定性研究时，由于大多数固定剂对酶都有钝化作用，样品制备或采用冷冻切片，或以冷丙酮、甲醛进行短期固定，以尽量保持酶的活性.,3/4/12,细胞生物学-研究方法,40,3/4/12,细胞生物学-研究方法,41,3/4/12,细胞生物学-研究方法,42,3/4/12,细
18、胞生物学-研究方法,43,三、特异蛋白抗原的定位与定性,(一)免疫荧光技术（immunofluorescence technigue）是将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术相结合用来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。它主要包括荧光抗体的制备、标本的处理、免疫染色和观察记录等过程。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,Bright field,Fluorescence,44,（二）免疫电镜技术,免疫荧光技术快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。在用抗原抗体反应的原理的基础上，使用电镜技术则能有效地提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。胶体金技术有下列优势：1、金颗
19、粒易识别，具很高的分辨率；2、可双重标记或多重标记,3/4/12,细胞生物学-研究方法,45,四、细胞内特异核酸序列的定位与定性,原位杂交技术（in situ hybridization）:用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置。细胞内特异核酸（DNA或RNA）序列的定性与定位通常采用此法.原位杂交技术首先是在光镜水平上开展，近年来，电镜原位杂交技术得到了发展。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,46,电镜原位杂交的基本原理与光镜原位杂交类似，只是探针标记物不同，以生物素等一些生物小分子代替同位素或荧光素标记探针，杂交反应的检测是通过与抗生物素抗体相连的胶体
20、金颗粒显示出来的。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,47,五、利用放射性标记技术研究生物大分子在细胞内的合成动态,20世纪70年代初，Caro用3H-亮氨酸对豚鼠胰腺的腺泡细胞进行脉冲标记：在脉冲标记3 min后，放射自显影银粒主要位于内质网；20 min后，银粒出现在高尔基体；120 min后则位于分泌泡并开始在顶端释放。（图）,3/4/12,细胞生物学-研究方法,48,实验说明了分泌性蛋白在细胞内的合成与转运途径：蛋白质的合成是在糙面内质网上的核糖体上进行：新合成的蛋白质随即转移到内质网腔中；从内质网再转移到高尔基体，收集包装成酶原颗粒：酶原颗粒转移到细胞顶端释放于细胞之外。,3/4/
21、12,细胞生物学-研究方法,50,六、定量细胞化学分析技术,（一）显微分光光度测定技术(microspectrophotometry）是利用细胞内某些物质对特异光谱吸收的原理，用来测定这些物质如核酸与蛋白质等在每一个细胞内含量的一种实验技术.如DNA对紫外线最高吸收波长是260 nm。经Feulgen染色反应后就可以吸收波长为546nm的可见光波.与分光光度仪测定溶液成分的方法相比，这种技术不仅可以定位，而且可以灵敏地测出一个细胞内某种成分的含量。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,51,细胞显微分光光度测定法可分为紫外光显微分光光度测定法与可见光显微分光光度测定法。,Degree of l
22、ignification in cell wall as determined by UV-microspectrophotometry(UMSP).Picture from Schmitt et al.2003.,3/4/12,细胞生物学-研究方法,52,（二）流式细胞仪（flow cytometry）可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量;特别是它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将DNA含量不同的中期染色体分离出来，因此近年来得到越来越广泛的应用。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,53,细胞群体一般需要分散,然后对待测的某种成分进行特异染色，再将悬液中的细胞以1个细胞ms的速度（1000万细胞/h）一个个地通过流式细胞仪;此时检测器便可测出并记录每个细胞中的待测成分的含量，并根据要求将该成分含量不同的细胞分离出来。,3/4/12,细胞生物学-研究方法,
