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1、细菌的噬菌体,一、一般性状,侵染细菌的病毒称为细菌的噬菌体，简称噬菌体。噬菌体由核酸和蛋白质外壳构成。噬菌体有丝状的、球状的，但大多数为蝌蚪状的。,蝌蚪状噬菌体,噬菌体的侵染,噬菌体接触到对它敏感的细菌时，它以尾部末端吸附细菌，其中DNA通过尾部注入到细菌细胞内，蛋白质外壳还留在细菌体外。注入细菌细胞内的DNA，控制和改变了细菌的代谢活动，并在其中复制噬菌体的DNA和蛋白质外壳，然后组成新的噬菌体。细菌就全部消解并释放新噬菌体。,噬菌体的侵染,噬菌体的侵染,噬菌斑,培养的细菌被侵染后就会发生明显变化，原来混浊的细菌悬浮液就会变清；在琼脂平板上的细菌就会出现无菌的透明斑，称为“噬菌斑”。,噬菌体
2、都有一定的寄生范围，有的寄生范围广，可以侵染一个属中不同种的细菌。甚至不同属的细菌称为多价噬菌体；有的寄生范围窄，仅能侵染同一种细菌，甚至种内的一个菌系，称为单价噬菌体。前者在研究细菌亲缘关系有作用；后者在细菌的鉴定上应用。,噬菌体的侵染范围,二、研究方法,噬菌体的分离噬菌体的纯化噬菌体的繁殖噬菌体的保存,1、噬菌体的分离,噬菌体的存在与寄主细菌有关，一般从寄主细菌所在的场所可以分离获得。植物病原细菌的噬菌体，可从感病植株的感病部位、病残体或者感病植株生长的土壤中分离获得。在土壤中分离时，因为土壤中杂菌较多，分离的噬菌体也可能不是单价的噬菌体，这时需要进行目标菌的诱发。即把目标菌倒入土壤中，过
3、一段时间后，再从土壤中分离噬菌体。,分离举例：,病组织提取液获得；将病组织切碎加水研磨滤纸过滤滤液5ml加入试管中加12ml氯仿加塞充分摇匀静止3060min,待分层用灭菌吸管取上层液作平板分离琼脂平板分离：提取液12ml和浓细菌悬浮液（109/ml）1ml 加入培养皿中混合，再加入45肉汁胨培养基（或其他培养基），待培养基凝固后，2628 培养，如果有噬菌体，1012小时后，琼脂平板上即可见噬菌斑。如果从土壤中分离，可用样本加水提取，离心；上清液1ml接种到30ml 培养液中（内接1ml浓细菌液），25 过夜，离心除去细菌，氯仿处理，平板分离。,分离液中的杂菌去除,氯仿处理：滤液氯仿（520
4、：1），摇匀，静止分层，取上清液作分离用。离心处理：60008000转/分，10分钟，可除去分离物中大部分杂菌。细菌滤器过滤：用56号细菌滤器过滤，此方法也会使噬菌体减少。加热处理：噬菌体的致死温度一般高于细菌，可用5560 处理提取液，以杀死细菌而不影响噬菌体。以上方法可以根据情况确定，有时需要几种方法配合使用。,平板分离,分离噬菌体的培养基：一般选用寄主细菌生长良好的培养基，固体和液体培养基均可；细菌菌龄：分离所用的细菌菌龄对噬菌体的繁殖影响很大，最好用对数生长期前的细菌（一般2448小时）；分离方法：（1）、提取液和细菌悬浮液混合涂抹于琼脂平板表面；（2）、提取液、细菌悬浮液和45琼脂培
5、养基混合。放置：2628 培养，1012小时后，琼脂平板上即可见噬菌斑。,2、噬菌体的纯化,从一个样本分离获得的噬菌体，可能不是同一个噬菌体，需要进一步纯化。噬菌体的纯化和细菌的纯化相似，噬菌斑就相当于细菌的菌落，纯化的方法是选择单个噬菌斑，用挑针刺一下，洗在约1ml灭菌的0.1%蛋白胨液中，就有足够的噬菌体。（一个噬菌斑的噬菌体量很大，直径约2mm的噬菌体数量可达107109个噬菌体）。配成的噬菌体悬浮液，按1：10的比例用0.1%蛋白胨水稀释若干次，然后用琼脂平板法培养，即可得到纯的噬菌体。,3、噬菌体的繁殖,纯化的噬菌体，繁殖后可用于性状的测定和保存。一般用三角瓶液体振荡培养寄主细菌，培
6、养2448小时后，接种一小块噬菌斑，再继续培养一段时间，待混浊的细菌悬浮液变清后，用细菌滤器过滤，除去残留的细菌，即为噬菌体悬浮液。,4、噬菌体效价测定,噬菌体的效价是指噬菌体的浓度，或者每毫升含噬菌体的数量。效价测定：将样本按1：10的比例稀释68次，在灭菌培养皿中加入不同倍数的稀释液，再加入浓细菌液和45的培养基，培养12小时，检查噬菌斑的多少（一个噬菌斑被认为是由一个噬菌体繁殖起来的）。,噬菌斑,5、细菌的鉴定,噬菌体用于鉴定之前，必须测定其寄主范围，测定时使用寄主和地理来源相近的菌株。单价噬菌体：只能侵染原来用于分离的寄主细菌，这类噬菌体就只能用于这类细菌的鉴定、分布等方面研究。多价噬
7、菌体：能侵染多种细菌，往往用几个多价噬菌体组合，研究不同细菌间的亲缘关系。,鉴定方法(1)、噬菌体样本多时的测定方法,噬菌体样本较多时使用此方法。在平板上先用涂抹棒接上目标细菌（横向涂抹），细菌生长24小时后，再纵向涂抹不同的噬菌体样本。一个平板上可测定几个噬菌体样本，培养后观察划线部位是否出现噬菌现象。,划线测定,(2)细菌亲缘关系测定,培养皿中加1ml待测定的噬菌体悬浮液，再加入45肉汁胨培养基，混匀。待琼脂平板凝固后，用灭菌的移植环蘸不同的细菌悬浮液在平板上划线。培养后观察测定的细菌能否生长。,6、噬菌体的保存,用0.1%蛋白胨液或肉汁胨培养液培养细菌，繁殖噬菌体悬浮液，过滤灭菌后保存。方法1：将噬菌体悬浮液装入灭菌安瓶中，封口，4保存，可保存几个月或几年。方法2：试管中先加入氯仿，再在其上面加噬菌体悬浮液，比例为1：120。不能用冷冻干燥方法保存，因可降低噬菌体存活率。,三、噬菌体的应用,植物病原细菌的鉴定：两个噬菌体系统：丁香假单孢菌 Pseudomonas syringae 油菜黄单孢菌 Xanthomonas camastris植物病害流行上的应用：植物病害防治：,
