《翻译后过程》PPT课件.ppt

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1、第六章 蛋白质生物合成-翻译及翻译后过程,一、蛋白质生物合成,转录(transcription),翻译(translation),基因,（DNA,nucleotide sequence),RNA(nucleotide sequence),蛋白质(protein,amino acid sequence),蛋白质生物合成,材料模板：mRNA(场所:rRNA（ribosome RNA)运输工具:tRNA(transfer RNA),CAACUGCAGACAUAUAUGAUACAAUUUGAUCAG,5,3,Genetic codon,翻译是沿着mRNA分子53方向进行,Message RNA),蛋白

2、质生物合成,多肽链的形成,多核糖体,蛋白质生物合成,需要掌握的几个概念，定义 mRNA:阅读框架（reading frames),开放阅读框架（open reading frames,ORF)原核生物：SD 序列，多顺反子mRNA 真核生物：帽子结构，Kozak序列,单顺反子mRNA,二、蛋白质合成后的折叠与修饰加工,（一）蛋白质的折叠（PROTEIN FOLDING)蛋白质一级结构 三级结构,蛋白质的折叠 从核糖体上释放出来的多肽链，按照一级结构中氨基酸侧链的性质，进行卷曲，形成一定的空间结构细胞内的蛋白质折叠与组装：在胞浆、线粒体或内质网（endoplasmic retinum，ER）,内

3、质网中的蛋白质折叠,内质网（endoplasmic reticulum;ER）：真核细胞细胞质内广泛分布的由膜构成的扁囊、小管或小泡连接形成的连续的三维网状膜系统。分为糙面内质网和光面内质网两种。粗糙型内质网：膜上附着核糖体颗粒 功能是合成蛋白质大分子，并把它从细胞输送出去或在细胞内转运到其他部 位。光滑型内质网：没有核糖体附在上面 功能与糖类和脂类的合成、解毒有关，并且还具有运输蛋白质的功能。,分子伴侣的发现：Laskey等(1987)研究非洲爪蟾核小体形成时发现一种酸性核蛋白nucleoplasmin。实验：在生理离子强度 下，体外把DNA与组蛋白混合在一起，不能自我组装，而是形成沉淀。如

4、果把组蛋白与过量nucleoplasmin混合，再加入DNA，则可形成核小体结 构，而且最终形成的核小体中没有nucleoplasmin。结论：它在DNA与组蛋白装配成核小体时是必需的。据此Laskey 称它为“分子伴侣”。分子伴侣（Molecular chaperone）的发现，说明细胞内新生肽段的折叠一般意义上说是需要帮助的，而不是自发进行的。,内质网 具有多种能加速新合成蛋白折叠蛋白质 伴侣蛋白Bip,钙连接蛋白(calnexin),钙网蛋白(calreticulin),蛋白质二硫键异构酶,肽 基脯氨酰异构酶(peptidylprolyl isomerases,PPI)内质网腔中的Bip

5、-ATP复合物能与肽链中疏水氨基酸(Trp,Phe及Leu等)结合,使该肽段保持伸展状态。Bip有ATP 酶活力,ATP 水解产能并从肽段上解离,肽段迅速折叠.若折叠不正确,Bip-ATP复合物能重新与它 结合,重复上述过程,直到肽段正确折叠为止.如,糖蛋白的糖链合成始于内质网.肽链边合成,边糖基化,边折叠.,内质网中的蛋白质折叠,未折叠或错误折叠的蛋白质留在内质网，永久地与内质网伴侣蛋白结合在一起,不能进行转运。内质网内的泛素化机制-泛素介导的蛋白酶解 泛素C-terminal Gly的羧基能与蛋白质中Lys残基的氨基形成肽键,使泛素与蛋 白质共价结合.,未折叠或错误折叠的蛋白质的去向,错误

6、折叠的蛋白质会被内质网中甘露糖苷酶（mannosidase）生成的一种“聚糖密码（glycan code）”所标记。然后，锚定在内质网膜上的泛素连接酶会破译该“密码”，需要被降解的蛋白质被转运出内质网，经由泛素化途径被26S蛋白酶体 降解掉，该过程也被称为内质网相关的降解途径（ER-associated degradation，ERAD）。,未折叠或错误折叠的蛋白质的去向,泛素连接酶蛋白的变异体蛋白Parkin与青少年帕金森氏病（juvenile Parkinsons disease）有关。表达缺陷型的Parkin蛋白可以导致Pael-R蛋白在内质网中聚集，继而导致多巴胺能神经元变性，形成帕金

7、森氏病。,参与蛋白质折叠的两类蛋白质助折叠蛋白1)折叠酶（folding enzymes,foldases）例如蛋白质二硫键异构酶可以识别和水解非正确配对的二硫键，使它们 在正确的半胱氨酸残基位置上重新形成二硫键2)分子伴侣（Molecular chaperone）分子伴侣是指细胞内一类能介导其他蛋白正确装配,其自身却不是具有功能的特殊的蛋白质分子 功能：促进多种多肽链的折叠或者阻止多肽的错误折叠。和部分折叠或没有折叠的蛋白质分子结合，稳定其构象，免遭其它酶的水解或促进蛋白质折叠成 正确的空间结构。细胞内帮助新生肽链正确组装为成熟蛋白质。真核生物中的HSP90、HSP70、HSP60都具有这种

8、功能,迄今为止发现的大多数分子伴侣属于热休克蛋白(HSP)的范畴。大致可分为4类非常保守的蛋白家族：nucleoplasmin家族，HSP60家族、HSP70家族、HSP90家族。广泛存在于动物、植物和微生物中。HSP：heat shock protein 细胞在应激原特别是环境高温诱导下所生成 的一组蛋白质。,蛋白质折叠研究的意义和前景 蛋白质折叠的研究 狭义的定义是研究蛋白质特定三维空间结构形成的规律、稳定性 和与其生物活性的关系。理论意义：蛋白质折叠机制的阐明将揭示生命体内的第二套遗传密码,到目前为止已发现有15-20种蛋白能发生病理性的聚合，形成淀粉样沉淀。朊病毒-引起的神经退性变疾病

9、是由于正常蛋白的错误折叠形成的致病蛋白-朊病毒蛋白(prion orotein PrP)在脑组织中累积而引起的PrP有两种形式；细胞型PrPc和异常型PrPsc。正常细胞中PrPc的序列以螺旋结构为主，折叠仅占11.9%若PrPc中的螺旋发生结构转换成折叠，则变成为异常型的PrPsc，其结构中折叠占43%。PrPsc蛋白聚集沉积，引起病状并有传染性。,蛋白质折叠 与疾病,牛海绵状脑病（俗称疯牛病）、羊瘙痒病、人克雅氏病、震颤病和吉斯综合症，老年性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固醇症、家族性淀粉样蛋白症、某些肿瘤、白内障等等,神经退性变脑组织内的聚集物,（二）蛋白质合成后的加工修饰,mRNA翻

10、译的多肽链没有功能，称为新生蛋白质或蛋白质前体，需要经过加工改造才能成为有功能的蛋白质。加工过程：1.前体加工：切除信号肽(N端1530个AA的前导序列为越膜信号)有限水解 去除蛋白内含子（protein intron)2.化学修饰：磷酸化，糖基化，有些蛋白质的N端乙酰化，C端酰胺化，二硫键的形成:mRNA上没有胱氨酸的密码子，多肽链中的二硫键在肽链 合成后，通过二个半 胱氨酸的硫氢基氧化而形成的，羟基化：胶原蛋白前链上的脯氨酸和赖氨酸残基产生羟脯氨酸和羟赖氨 酸，从而加强其的张力强度。,1.氨基端和羧基端的修饰 在原核生物中几乎所有蛋白质都是从N-甲酰蛋氨酸开始，真核生物从蛋氨酸开始。甲酰基

11、经酶水介而除去，蛋氨酸或者 氨基端的一些氨基酸残基常由氨肽酶催化而水介除去。包括除去信号肽序列。因此，成熟的蛋白质分子N-端没有甲酰基，或没有蛋氨酸。同时，某些蛋白质分子氨 基端要进行乙酰化在羧基端也要进行修饰。,2.共价修饰 细胞内几乎所有的蛋白质在核糖体合成后都要经过共价修饰,蛋白质的共价修饰发生在N端,C 端或内部残基侧链的活性基团上.修饰后能改变蛋白质活性,可以表现为激活状态，也可以表现为失活状态。改变蛋白质寿命及细胞内定位1）糖基化：质膜蛋白质和许多分泌性蛋白质都具有糖链，这些寡糖链结合在丝氨酸或苏氨酸的羟基上 如红细胞膜上的ABO血型决定簇。也可以与天门冬酰胺连接。这些寡糖链是在内

12、质网或高尔基氏体中加入的,糖基化,糖蛋白中常见的糖一肽连接键,2）磷酸化：磷酸化多发生在多肽链丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上的羟基，这种磷酸化的过程受细胞内一种蛋白激酶 催化，蛋白激酶 催化ATP 中的磷酸基团转移到氨基酸残基的功能基团上.磷酸化后的蛋白质可以增加或降低它们的活性 例如：促进糖原分解的磷酸化酶，无活性的磷酸化酶b经磷酸化以后，变居有活性的磷酸化酶a。而有活性的 糖原合成酶I经磷酸化以后变成无活性的糖原合成酶D，共同调节糖元的合成与分介。已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶蛋白激酶可分成三类:丝/苏氨酸蛋白激酶,如PKA,PKC,癌基因产物

13、Raf等Tyr蛋白激酶(TPK),如生长因子受体,胰岛素受体,Src蛋白等.双功能蛋白激酶,如促分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK);,signal,蛋白质磷酸化修饰及其对生理过程调控作用的特点可逆性 蛋白质磷酸化后可被磷酸酶水解除去磷酸基团而恢复原状.磷酸化既有活化又有抑制效应快速高效 级联式反应 物质代谢途径和信号转导途径中往往有一连串 的蛋白质磷酸化,构成级联反应,从而产生放大效应,同时各级 反应都有可调控性广范存在与时空分布 蛋白质磷酸化广泛存在几乎一切生命活动中,但个别蛋白质的磷酸化修饰有细胞周期特异性,发育阶段特异性,组织特异性而呈现时空特异的分布.,3)氨基的甲基化和乙酰化 蛋白

14、质中的氨基甲基化：肌动蛋白中His 残基N3位的甲基化,组蛋白中Lys残基的氨基甲基化,细胞色素c,钙调蛋白(calmodulin,CaM)的甲基化等.Lys残基的甲基化可消除正电荷.4)蛋白质乙酰化 80%的蛋白质有末端氨基的乙酰化.蛋白质的乙酰化能延长蛋白质在细胞内存在的时间,而组蛋白的乙酰化与染色质活化,染色质复制与组装,细胞分化和细胞癌变等有关,组蛋白乙酰化与癌症（Histone Acetylation and Cancer）负责组蛋白乙酰化和去乙酰化的是一对功能相互拮抗的蛋白酶组蛋白乙酰化转移酶（histone acetylases,HATs）和组蛋白去乙酰化酶（Histone de

15、acetylases,HDACs）,HATs-通过在组蛋白赖氨酸残基乙酰化,激活基因转录,HDACs-使组蛋白去乙酰化,抑制基因转录,组蛋白乙酰化和去乙酰化与基因的表达调控密切相关,HATs和HDACs之间的动态平衡控制着染色质的结构和基因的表 达 组蛋白乙酰化状态的失衡与肿瘤发生密切相关.研究发现,肿瘤细胞的组蛋白大部分呈低乙酰化状态 细胞内组蛋白乙酰化调控机制设计开发抗肿瘤药物成为研究热点.组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以增强细胞内组蛋白乙酰化状 态,从而改变肿瘤的生物学特性,HDAC抑制剂主要作用的机制-通过抑制HDAC阻断由于HDAC募集功能紊乱而导致的基因表达受抑制，从而达到治疗的目的。理

16、想的HDAC抑制剂应具备 以下特征：（1）抑制HDAC酶的活性；（2）使HDAC从靶基因启动子解离；（3）促进HAT定位于靶基因启动子。HDAC抑制剂被开发并在临 床上得到应用 按结构可分为4类：（1）短链脂肪酸，如丁酸钠（2）氧奎酸类，如曲古菌素（3）环形四肽类，如trapoxin A FR901228(FK228)和apicidm等；（4）苯酸胺类。其中丁酸钠及其异构体已进入实体瘤一期临床应用。,组蛋白去乙酰化酶抑制剂的开发,5）羟基化：胶原蛋白前链上的脯氨酸和赖氨酸残基在内质网中受羟化酶、分子氧和维生素C作用产生羟脯氨酸和羟赖氨酸，如果此过程受障碍胶原纤维不能进行交联，极大地降低了它的张

17、力强度。,6）二硫键的形成：mRNA上没有胱氨酸的密码子，多肽链中的二硫键，是在肽链合成后，通过二个半胱氨酸的疏基氧化而形成的,催化二硫键重排的酶是蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI).二硫键异构酶是一种含有巯基的酶,能随机切断,并催化多种蛋白质中二硫键的形成,使之正确折叠成稳定的构象.,3.亚基的聚合：有许多蛋白质是由二个以上亚基构成的。例如成人血红 蛋白由两条链，两条链及四分子血红素所组成。大致过程如下：链在多聚核糖体合成后自行释下，并与尚未从多聚核糖体上释下的链相连，然后一并从多聚 核糖体上脱下来，变成、二聚体。此二聚体再与线粒体内生成的两

18、个血红素结合，最后形成一个由四条肽链和四个血红素构成的有功能的血红蛋白分子。4.水解断链：一般真核细胞中一个基因对应一个mRNA，一个mRNA对应一条多肽链，但也有少数的情况，翻译后 的多肽链经水介后产生几种不同的蛋白质或多肽。例如哺乳动物的鸦片样促黑皮激素5.剪接,POMC作为多种活性物质的前体,第一行为POMC前体，K、R为赖氨酸和精氨酸残基,原初翻译产物为265个氨基酸，它在脑下垂体前叶细胞中，POMC初切割成 为N-端片断和C端片段的-促脂解激素。然后N端片段又被切割成较小的N端片断和工9肽的促肾上腺皮质激素。而在脑下垂体中叶细胞中，-促脂解激素再 次被切割产生-内啡肽；ACTH也被切

19、割产生13肽的促黑激素（-melanotropin）。,初级产物多肽链,天然蛋白质,思考题,1.蛋白质合成过程及涉及因素2.蛋白质合成后如何成为活性蛋白？（经过哪些过程和方式？）3.蛋白质在形成活性蛋白过程中发生错误将产生什么后果？4.研究 蛋白质在形成活性蛋白过程中发生错误的机制对药物的研发有 什么指导意义？,（三）蛋白质转运,虽然蛋白质的翻译绝大多数在胞浆进行，但有许多蛋白质的折叠和最后的成熟常常需要转运到其他细胞器才能完成，这些细胞器包括线粒体、叶绿体、过氧化物酶体（peroxisomes）和内质网（ER）。如：受体蛋白，离子通道蛋白，转运蛋白 细胞膜DNA，RNA聚合酶 细胞核蛋白酶

20、溶酶体过氧化氢酶 过氧化氢酶体细胞外间质，激素 细胞外,膜结合核糖体,游离核糖体,细胞质基质,细胞核,溶酶体,高尔基体,内质网,线粒体,过氧化物酶体,分泌颗粒,内体,细胞表面,核糖体,游离核糖体,膜结合核糖体,不同部位的蛋白质如何准确地到达目的地？,1999年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国洛克菲勒大学细胞分子生物家君特布洛贝尔(Blobel,G)，发现蛋白质因具有信号序列而决定其在细胞内转运和定位。提出问题：不同类型蛋白质在细胞质合成后如何转运到应该去的部位?如何转运至细胞器内或细胞外?认为 关键是阐明蛋白质穿越细胞或细胞器膜(即转运transfer,或移位translocation)的细胞分

21、子机制。选择内质网为研究 模型：从内分泌性蛋白质向内质网转运入手研究蛋白质转运的机制,提问：转运的蛋白质在其合成过程和结构上有何特点呢？Blobel从中发现了2条重要线索：(1)被转运蛋白质的初生肽(即其前身物)比成熟肽大；(2)被转运的分泌性蛋白质进入内质网的过程与其生物合成的过程是平行进行的。推断：初生肽长出的那段肽链可能是专门起引导作用的“信 号肽”（signal peptide或signal sequence)，只有存在信号肽，才可能穿越膜结构，否则不能实现跨膜转运。证明：信号肽的存在及其与蛋白质跨 膜转运的关系结论：1971年提出了蛋白质跨膜转运的“信号假说”(signal hypo

22、thesis),假说的要点：是当被转运的蛋白质肽链的合成在mRNA起始密码上启动后，首先合成一段含1530个氨基酸的信号肽，它被内质网 膜上的受体蛋白所识别并相互结合，此时受体蛋白可聚合而产生膜内通道，此外内质网膜上核糖体受体蛋白还可与核糖体结合形成延伸出去的通道，这样，当蛋白质 肽链合成继续进行的同时，信号肽率先经过通道进入内质网，随后信号肽被膜内侧的信号肽酶水解掉，蛋白质再变成成熟蛋白质。信号肽是小肽，其中部为约1214个氨基酸残基(大多为疏水性)组成的片段，前部为带正电荷的碱性氨 基酸残基，末端为富含丙氨酸的片段，也是信号肽酶的水解部位。,The signal sequence init

23、iates membrance entry,信号假说中还存在第2个关键问题：内质网膜是如何识别信号肽的?发现细胞内一种叫做“信号识别蛋白”（signal recognition protein,SRP)的蛋白质因子在内质网膜识别信号肽的过程中起重要作用。实验：狗胰脏细胞内质网小泡的盐抽提物中提取到一个沉降系数为11S的蛋 白质核酸复合体 SRP 实验结果表明，SRP一方面可与内质网膜上的受体结合以便形成通道让信号肽通过，另一方面也可离开膜进入细胞质与信号肽结合，二者达成动态 平衡。因此可以说SRP是介导内质网膜识别信号肽的关键性因子。,SRP功能：介导新生肽链与内质网膜结合，在核糖体没有与内质

24、网结合时，阻止肽链延长,蛋白质向内质网跨膜转运的细胞分子生物学机制示意图,Blobel还于1980年总结出如何分类鉴别对应于 不同细胞区域的蛋白质，提出每个蛋白质都有指明其在细胞中正确位置的信息，氨基酸序列决定了一个蛋白质是否会穿过膜进入另一细胞器或转运到细胞外。,Blobel科学发现的意义和价值 理解某些医学机理,尤其是一些遗传病。例如，由于信号出现错误，新合成的蛋白质会在细胞内错误的部位“安家”，从而产生异常的表型，如导致高草酸盐尿症，在较早年龄阶段引发肾结石。信号错误还可引发膀胱纤维化和其他一些疑难病症。肝脏过氧化丙氨酸-乙醛酸盐氨基转移酶缺乏，导致草酸产生过多.临床表现为高草酸尿症和反

25、复尿路结石。由于肾移植术后患者仍存在草酸代谢障碍，复发率极高指导基因工程生产蛋白质防治药物时的设计:欲在细胞培养中生产基因工程产品，在目标基因的前面设计一段信号肽，变成可 分泌性蛋白质而分泌到细胞外培养液中，从而提高了产品的产量和质量，减少了下游工作的难度。,细胞根据蛋白质是否携有分选信号，以及分选信号的性质，选择性地将其送到细胞不同的部位，这一过程称为蛋白质分选和蛋白质靶向运输。大多数蛋白质带有分选信号,细胞内蛋白质合成后精确转运到特定细胞器取决于两个因素：1.蛋白质包含的特殊信号序列（signal sequence,targeting sequence)2.细胞器上具有特定信号识别装置（分

26、选受体，sorting receptor)在进化过程中，每个蛋白形成了一个明确的地址签（address target),细胞通过对蛋白质地址签的识别进行运送，这就是蛋白质的分选（protein sorting),分选信号引导蛋白质到达正确的地点,分选信号有两类 信号肽peptide signal：新合成蛋白质的N-末端有一段信号序列，其作用是将肽链在合成过程中引导至内质网膜上，并在内质网中完成蛋白质合成，信号序列本身则在蛋白质合成完成前在内质网中被切除。信号肽可位于多肽链的任何部位，完成分选任务后常被切除。,2.信号斑plaque signal：位于多肽链不同部位的几个特定氨基酸序列经折叠后形

27、成的斑块区，具有分选信号的功能。信号斑是一种三维结构。完成分选任务后仍然存在。,不同的氨基酸序列作为分选信号决定蛋白质运输的方向,细胞中蛋白质的运送有两种方式：共翻译运输（co-translational translocation),翻译同步转运翻译后运输(post-translational translocation),翻译同步转运：蛋白质在游离核糖体中先合成N端 信号序列（即内质网信号序列），信号序列介导核糖体和内质网膜结合，使新生肽边合成边进入内质网（ER lumen)或插入内质网膜。,伴侣蛋白细胞质中，新合成的蛋白质与一个或多个伴侣蛋白结合以防止蛋白质聚集并使其保持伸展状态。这些伴

28、侣蛋白包括细胞质Hsp70和线粒体输入刺激因子（MSF)在基质中，基质Hsp70与进入基质的蛋白质结合以防止蛋白质聚集和错误折叠有些蛋白质进入基质后能自己折叠成最终构想，但许多蛋白质还需要Hsp60辅助。,转运到细胞核（nuclear)蛋白质是通过核膜上的孔进入细胞核输入细胞核的蛋白质都含有核定位信号序列（nuclear localization signal,NLS)NLS 的特征是：含一段或两段富含碱性氨基酸残基的信号序列碱性氨基酸上游有一个Pro，以防止 helix的形成；疏水氨基酸残基很少,输出细胞核的蛋白质则含有一个核输出信号序列（nuclear export signal,NES)

29、.NES 由大约10个氨基酸残基组成，富含Leu蛋白质转运涉及到多种蛋白质和辅助因子，如转运受体importin 和exportin，分别负责蛋白质输入和输出，还有Ran等。,翻译后转运小泡运输机制小泡转运是指一种细胞器的膜局部突起形成小囊，萌发的小囊与供体膜分离形成独立的小泡，然后小泡把携带的蛋白质运输到另一个细胞器。小泡与受体细胞器的膜融合，完成蛋白质的运输。另外，细胞的胞吞作用（endocytosis)也是由小泡完成的。小泡的萌发、形成及融合需要许多蛋白质参与,受体介导的胞吞作用和内化蛋白质的分拣受体介导的胞吞作用(receptor mediated endocytosis 指细胞表面的

30、特异受体识别细胞外大分子(配体)并与之紧密结合,含有受体-配体复合物的细胞膜区内化(internalization)而形成转运小泡,选择性地把受体-配体复合物掺入小泡进行运输配体内化的效率取决于其在细胞表面对应受体的浓度细胞表面由一些由小窝蛋白(caveolin)组成的小窝(caveolae).这些小窝含有一些受体蛋白,能介导特定类型的胞吞作用.但大多数受体介导的胞吞作用形成的是网格蛋白包被的小窝和小泡,LDL 的胞吞low density lipoprotein;LDL 在血浆中起转运内源性胆固醇及胆固醇酯的作用。主要功能是把胆固醇运输到全身各处细胞，运输到肝脏合成胆酸。体内2/3的LDL是

31、通过受体介导途径吸收入肝和肝外组织，经代谢而清除的。其浓度升高与动脉粥样硬化的发病率增加有关LDL的降解：经LDL受体途径进行代谢，细胞膜表面的被覆陷窝是LDL受体存在部位，即LDL中的ApoB100被受体识别，将LDL结合到受体上陷窝内，其后再与膜分离形成内吞泡，LDL与受体分离并与溶酶体融合后，再经酶水解产生胆固醇进入运输小泡体，或者又经ACAT作用再酯化而蓄积。一旦LDL受体缺陷，VLDL残粒由正常时大部分经肝LDL受体识别，而改为大部分转变成LDL，使血浆中LDL浓度增加。,受体介导的胞吞作用的功能将胞外代谢物运输到胞内,如铁离子,LDL,维生素B12等是细胞应答肽类激素和生长因子的调

32、节方式之一.通过胞吞作用可灭活激素或生长因子.细胞表面受体的减少使细胞对激素及生长因子的 应答减弱,称为受体的下降调节将环境中需要降解的蛋白质通过内吞作用进入细胞后运输到溶酶体,如巨噬细胞清除血液循环中损伤的蛋白质某些病毒或及细菌毒素能通过这种作用进入细胞.如HIV 病毒,白喉毒素等,思考题,1.何谓蛋白质转运？（为何蛋白质需要转运？转运到什么地方？）2.转运过程需要哪些因素帮助？3.了解蛋白质转运有何实际意义？4.细胞中蛋白质转运有哪两种方式？5.转运到细胞核的蛋白质有何特征？,第五节 功能蛋白质研究进展功能蛋白质结构特点（1）基序（motif）二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近

33、，形成一个特殊的空间构象，称之为基序或模体。特点:一个基序具有特征的氨基酸序列，并发挥特殊的功能。锌指结构（zinc finger）:特征:通过肽链中氨基酸残基的特征集团与Zn2+的结合来稳定一种很短的，可自我折叠成“手指”形状的的多肽空间构型,锌指蛋白因其包含特殊的指状结构,在对DNA、蛋白质和RNA 的识别和结合中起重要作用.如含锌指基序的转录因子：与GC盒结合的SPl、类固醇激素受体家族，抑癌蛋白WT1等应用:工程锌指蛋白（Engineered zinc finger protein）Generating arrays of engineered Cys2His2 zinc finger

34、s is the most developed method for creating proteins capable of targeting desired genomic DNA sequences.应用这个技术制备人工转录因子,激活VEGF表达用于疾病治疗制备锌指核酸酶作为研究基因组试剂,锌指核酸酶干扰CD4+人T-Cells的CCR5基因作为治疗HIV/AIDS方法正在临床试验,亮氨酸拉链(leucine zipper motif,ZIP)蛋白质中常见的结构模体，某些DNA结合蛋白的一级结构C末端区段，亮氨酸总是有规律地每隔7个氨基酸就出现一次。定义：由一组(通常是45个)重复片段

35、组成，每个重复片段的第7个氨基酸残基均为亮氨酸，当2个带亮氨酸的-螺旋蛋白质分子平行排列时，形成的对称二聚体最初发现于DNA结合蛋白，但也可存在于其他类型蛋白质,（2）结构域（domain）分子量大的蛋白质三级结构常可被分割成一个或一个以上的球状或纤维状的区域，折叠的较为紧密，各行其功能，称为结构域。在蛋白质三级结构内的独立折叠单元。结构域通常都是几个超二级结构单元的组合结构域是介于二级和三级结构之间的另一种结构层次。所谓结构域是指蛋白质亚基结构中明显分开的紧密球状结构区域，T淋巴细胞表面受体结构域,噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因

36、随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。,噬菌体展示(phage display)是在噬菌体表面表达已融合到噬菌体外壳蛋的重组蛋白或多肽；噬菌体展示技术是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术，以改造结构的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质 表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法表达有特异肽或蛋白质的噬菌体.,丝状噬茵体是单链DNA病毒，pIII是病毒的次要外完蛋白（minor coatprotein）、位于病毒

37、颗粒的一端，每个病毒颗粒都有35个拷贝pIII蛋白，pIII有两个位点可供外源序列插入,单链丝状噬菌体,(1)在p 和p 衣壳蛋白的N 端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响和干扰噬菌体的生活周期，同时保持的外源基因天然构象，也能被相应的抗体或受体所识别；(2)利用固定与固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗(panning)方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体；(3)外源多肽或蛋白质表达在 噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA 测序推导出来.该技术实现了基因型和表型的转换.,应用噬菌体展示，可合成、筛选到许多我们想要的蛋

38、白（如融合肽、抗体、酶），这些蛋白具有预期的催化特性或结合亲和力，或者具有用于胞内、胞外诊断、人体疾病免疫治疗和生物催化作用时所需的特异性,三、蛋白质组学(proteome)和药物蛋白质组学基因组研究提示，人类至少有数万个基因和更多的蛋白。其中许多蛋白是控制人类疾病的药物潜在靶点，粗略估计大约有5000-10000个。然而在过去100 年中发现的靶点，仅约有500-1000个蛋白药物蛋白质组学的重要研究内容在临床前包括新药和靶的发现、药物作用模式、毒理学研究，在临床研究方面包括疾病特异性蛋白作为有效患者选择的依据和临床试验的标志。应用类似于药物遗传学的方法，按照蛋白质谱来分类患者，并预测药物作

39、用疗效。,仅仅通过测定基因序列并不能确定药物作用的靶点，因为基因序列不能反映蛋白的功能及其与疾病的关系，另一方面蛋白质也远比核酸复杂，（1）与DNA的修饰不同，蛋白质的修饰有磷酸化、糖基化、乙酰化、巯 基化等以及大量的其它修饰方式；（2）一个基因能编码多个不同的蛋白；（3）蛋白在细胞内的定位可以改变；（4）蛋白对环境的变化也会产生反应，如裂解为片段，调整其稳定性以 及改变与其它物质的结合等（包括与其它的其它配体结合）（5）mRNA水平常常不反映蛋白表达的水平，而且即使存在一个开放阅 读框架也不能保证只代表一个蛋白；（6）一个蛋白可能涉及一个以上的过程，而相似的功能可能由不同的蛋白来执行。因此，

40、可以说只有完全注释了基因组序列所编码蛋白的功能之后，基因组序列信息才有真正的价值。,悉尼的maquarie大学的marc wilkins和keith williams 首先提出“蛋白质组”的概念，并将其定义为系统鉴定基因组所互补的全部蛋白质，或功能地注释全部基因组。,药物蛋白质学研究的内容临床前：发现所有可能的药物作用靶点 针对这些靶点的全部可能的化合物（有人称此为化学基因组 学（chemogenomics）应用蛋白质组学方法研究药物作用机制和毒理学临床研究方面：药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的依据和临床诊断的标志物，或以蛋白质谱的差异将患者分类并给予个体化治疗,蛋白质组学及其技术：利

41、用蛋白质组学技术，研究疾病状态下以及药物处理后蛋白的差异变化，可以发现新的、潜在的药物作用靶点。蛋白质组学是一个实验科学，需要大规模的定性和定量纯化的蛋白，蛋白质的纯化是药物蛋白质组学研究的基础。,蛋白纯化是蛋白质组学研究的基础(一)蛋白纯化的质量控制对保证蛋白的纯度和结构的完整是重要的。大约有50%的蛋白不溶解，而且有不稳定的结构，因此处理不当，用错误折叠的蛋白作生化研究和药理活性筛选将可能出现假阳性或假阴性的结果，不仅导致靶点鉴定的错误，而且也会浪费时间和精力，更为严重的是这些错误信息将可能污染数据库。二）两维（2D）凝胶电泳技术是蛋白分离的主要手段 虽然人类有十余万个蛋白，但在任何特定的

42、细胞类型中只有部分表达。为了发现和检测一个蛋白与疾病过程的关系，了解蛋白在什么组织、细胞、亚细胞结构，以及何时，在什么范围内表达，需要直接测量蛋白的丰度变化,有多种测定蛋白丰度变化的技术，最流行和通用的技术是电泳（包括一维和两维电泳）、结合色谱与质谱（MS）技术用这种方法，可有效地分离细胞提取物中的蛋白混合物，然后用肽质量指纹图谱法，鉴定每一个蛋白。由于蛋白质常与其共同作用的成分存在于细胞内，因此从细胞裂解后，完整的混合物中鉴定新蛋白常常有助于了解它们的生物学功能.通过筛选小分子配体来描述新蛋白的功能，是化学蛋白质组学的主要研究内容，化学蛋白质组筛选也将提供新药开发的先导化合物。盲目筛选蛋白参

43、与的生化或生理反应是不可行的，但筛选已知药理作用的小分子与新蛋白的结合，可能有助于了解蛋白的功能。一旦创造了小分子数据库，可以用于筛选家族中的多个靶。,例如在信号转导过程中，大约有500个丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸蛋白激酶，具有同源序列，蛋白激酶家族不仅存在序列同源，而且在结构上也存在明显的同源性。化合物staurosporine，不仅能抑制丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶，而且该化合物也可能作发现其它高特异抑制剂的一个原型药物.已经在激酶的同源模型上证实，简单地修饰staurosporine，可以增加特异性。对丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）的最新研究，已经发现了许多由相关序列的蛋白质构成的激酶瀑布

44、，其中每条途径不仅可以提供多种潜在的干预靶点，而且在不同的转导途径成员间有高度的序列同源性。,药物蛋白质组学方法应用蛋白质组学技术，利用人类基因组序列和蛋白质结构信息并结合其它平行发展的方法如组合化学，高通量筛选，计算机化学和生物信息学等，将促进新靶点的发现和验证，并设计和产生出新的先导化合物发展新技术人类将致力于将实验科学发展到硅科学，希望能用计算机的方法预示生理学和药理学的变化。应用基因组或蛋白质组的数据库，作模式识别的计算，发现新的知识和新的关于蛋白和细胞功能的假说，用这种方法产生的假说比利用相对少的实验资料产生的假说更有价值，虽然这类数据库现在还不全面，但正在完善。应用计算机研究单个蛋白到蛋白网络，然后到整个细胞途径，将显著增加药物发现过程的效率。,思考题锌指结构，亮氨酸拉链结构特征基序，结构域定义,