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1、第五章 PCR技术原理,定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。,PCR技术:,PCR概念的提出,1983，Kary Mullis,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。不耐高温。,Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process,thermus aquaticus,Taq DN
2、A多聚酶的发现,1988年Saiki 等从温泉（Hotspring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。,此酶具有以下特点：耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在1989年，Science将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear),1、PCR技术的基本原理,在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板D
3、NA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。,一、PCR技术的基本原理和工作方式,94变性,50-65退火,72延伸,2.PCR反应过程：,20-40个PCR循环,1个PCR循环,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,模板：单链或双链DNA 引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTT
4、P、dCTP、dGTP)Mg2+：DNA聚合酶的激活剂,3.PCR基本要素,4.PCR反应程序9496 30-3 预变性（使模板DNA充分变性）94 30 变性50-60 30-1 复性（使引物与模板充分退火）72 n(按1扩增1kb计算）延伸 72 3-7 总的延伸（使产物延伸完整）4-10 保存,1）复性和延伸温度 复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60 之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定（低于Tm 值2-3）。延伸温度绝大多数设定为 72。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法 PCR。2）反应时间 变性一般使用 30 秒
5、钟，如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有 30 秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间。,3）循环次数 循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为 2535 次。平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。,4）PCR 反应液
6、的配制 最后加入 DNA 聚合酶。早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。,总体积 50-100 l 缓冲液 dNTP（底物）引物 模板 DNA聚合酶,5、反应体系,缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM TrisHCl（），1.5mM MgCl2，50mM K+dNTP（底物）：等摩尔浓度的 4 种 dNTP（即 dATP、dTTP、dCTP和dGTP），终浓度一般为 200mM（即饱和浓度），dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。引物：1M/L,引物
7、设计的一般原则,长度：至少 16bp，通常为 18-30bp。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5。对于小于 20 个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计算，即 Tm=4（G+C）+2（A+T）。对于 14-70 个核苷酸的引物可用 以下公式计算。Tm=81.5+16.6（1gK+）+0.41（G+C）%-（675/N）N 表示引物的核苷酸数目，K+表示单价离子即钾离子的浓度 避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的 3端）。G+C 含量：尽量控制在 40%至 60%之间，4 种碱基的分布应 尽可能均匀。尽
8、量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在 3 末 端的重复排列。引物的 3 末端最好是 G 或 C，但不要 GC 连排。,模板：单、双链DNA均可。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过 高会导致反应的非特异性增加。DNA聚合酶：最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75。Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3-5 外切活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,6.PCR技术的特点,1）高度的灵敏性,2）特异性,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增
9、效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,3）操作简便易行,PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA 扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。,4）用途广泛,生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学,1.长片段DNA的PCR扩增常规PCR长度为2kb以下。长片段PCR扩增存在的问题：（1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低（2）高温会损坏模板DNA和PCR产物（3）高温下其他二价离
10、子的存在会促进DNA的裂解（4）长片段DNA分子的变性比短片段困难，DNA聚合酶与模板DNA的趋近和接合变得困难（5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发挥，从而限制产物的长度,二、PCR的类型,改进：(1)改进缓冲体系(2)采用混合DNA聚合酶 主体使用扩增效率高，延伸能力强的Taq DNA聚合酶；少量使用具有35外切酶活性的高温DNA聚合酶，及时切除不匹配碱基的掺入。,2.PCR扩增未知DNA片段1).染色体步查（移）（chromosome walking）：是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步获得与其相邻的未知序列的核苷酸组成的方法和过程。,2).反向PCR(in
11、verse PCR),一种简单的扩增已知序列周边序列的方法。,扩增原理：,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,步骤：,首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板 DNA，再将酶切后的 DNA 片段连接成环状分子，最后根据已知片段两端的序列设计引物，PCR扩增邻近的DNA 片段。,3).利用接头的PCR,步骤：(1)基因组DNA的限制性内切酶酶切，（2）接头与限制性内切酶片段的连接，（3）已知序列侧翼未知序列的PCR扩增（利用分别根据已知序列和接头序列设计的引物）。,4).（1）热不对称交错PCR,TAIL-PCR的基本原理：利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（
12、简称sp1，sp2，sp3），用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物（arbitrary degenerate prime，AD，约14bp）相组合，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。,第一次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环。5次高特异性反应，使sp1与已知的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火，随后进行12次超级循环。,第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过10次热不对称的超级循
13、环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环，通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。,sp1，sp2，sp3,随机引物,高浓度引物,低浓度引物,（2）不对称PCR,3.与反转录相关的PCR扩增,RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR):又称反转录PCR,是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，可对基因的表达和序列多态性分析。,聚合酶,cDNA,PCR扩增,AAAnA,AAAnA,逆转录酶,反转录,T T TnT,cDNA第一链,mRNA,1）cDN
14、A末端的快速扩增（rapid amplification of cDNA end,RACE)(a)5RACE：,GSP3,设计引物，合成cDNA第一链,AP,AAAAA.AAAAn,TTTTT.TTTT,5,用RNase降解模板mRNA,纯化cDNA第一链,TTTTT.TTTT,GSP1,AUAP,GSP2,(b)3RACE,特异性引物与接头引物对cDNA的PCR扩增,2)差异显示PCR:(Differential display reverse transcriptase-PCR,DDRT-PCR),使用3端的锚定引物（T12MN），通过反转录过程，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分
15、成大致相等但序列结构不同的12亚份群体，这一过程叫差异显示反转录(DDRT).,锚定引物的通式是oligo(dT)12MN，M：A、C、G；N：A、C、G、T共有12种oligo(dT)12MN引物。,4.PCR产生DNA指纹,1）多重PCR(multiplex PCR)：设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片断，这一过程称之为多重PCR.,使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低的复性温度下(36)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR扩增反应后可以产生多个PCR产物。
16、经凝胶电泳可以将上述多个PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性DNA(random ampification polymorphic DNA,RAPD),2）随机扩增多态性（random ampification polymorphic DNA,RAPD）,是针对基因组DNA的限制性酶切片断进行选择性PCR扩增而建立DNA指纹的技术。1）基因组DNA的限制性内切酶酶切，2）（与酶切片段末端相对应的）接头与酶切DNA片段的连接，3）（含有接头序列和酶切位点序列及延伸序列的）引物对连接产物作PCR扩增。,3）扩增片断长度多态性（AFLP,amplified fragment l
17、ength polymorphism）,GAATTC,CAATTG,TTAA,AATT,G,AATTC,T,AAT,GAATTCMNV,MNVAATT,核心 酶切 延伸序列 位点 序列,7.实时定量PCR(real-time PCR),常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量及定性分析,（1）原理：通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程中每一轮循环产物的累积数量，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量PCR。,域值：将荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的荧光强度设定为域值。Ct值：荧光
18、信号达到域值所对应的循环次数称为Ct值。,定量曲线,可以检测扩增产物的纯度,溶解曲线,SYBR荧光染料（SYBR green)TaqMan 探针发夹型杂交探针,（2）荧光标记方式,TaqMan 探针工作原理,三、PCR产物的克隆,1添加限制性酶切位点 1）通过引物设计引入酶切位点 2）酶切位点应加在引物的5端 3）添加的酶切位点在扩增的DNA片断内部存在 4）由于添加的酶切位点位于DNA片断的末端，因此必须考虑末端长度对切割的影响。,E H,E H,2A/T 克隆1）PCR产物：主要适用于Taq DNA聚合酶扩增产物。Taq DNA聚合酶具有末端转移酶的活性，可在DNA片断的3末端添加一个核苷酸，通常为A。,2）T-载体,载体特点：将普通的克隆载体切成线状，并使之3末端含有一个突出碱基T.,3平端克隆 连接效率较低 T4DNA连接酶 特殊的载体,
