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1、1,第二章 发酵原理,第四节 发酵学第三假说：细胞经济假说,2,微生物细胞是远离平衡状态的不平衡的开放体系，是在物竞天择的基础上形成的细胞经济体系。细胞经济体系为微生物细胞的适应性、经济性和代谢的持续性提供保障。是细胞生存的保障体系。,“细 胞 经 济 假 说”,3,本部分将从代谢和代谢调节的角度分析细胞生命活动的经济规律，以求比较圆满地处理工业发酵目的与细胞经济运行之间的对立和统一关系，从而能顺应自然规律，主动与微生物合作，为人类造福。,4,细胞经济假设的微生物学基础是：微生物代谢的自动调节 微生物代谢的自动调节最终借助于酶与膜来实现，其自动调节机制的信息都存在于DNA中。,代谢调控的目的：
2、1.高效利用养分；2.快速响应环境变化。,5,代谢的协调能保证在任何特定时刻、特定的细胞空间，只合成必要的酶系（参与代谢的多种酶）和刚够用的酶量。并且，已合成的酶的活力受到许多调节机制的控制，主要是在反馈信息的触发下发生的抑制、激活、阻遏、诱导等基本调节机制。这些调节机制的协同作用为微生物细胞的新陈代谢、细胞的经济运行提供保证。,6,真核生物与原核生物的调节系统比较：真核生物与原核生物的调节系统是有很多不同的，这是它们不同“生活方式”的反映。虽然原核细胞与真核细胞所具有的很多功能颇为类似，但它们在若干结构的及遗传的性能方面有区别。,一、微生物细胞中代谢调节的部位,7,原核细胞通常是自由生活的单
3、细胞生物，在环境条件适宜且营养充足的情况下，它们在理论上是可以无限制地生长和分裂的。原核生物系统的调节方向是尽可能高效利用营养实现最大生长。由于没有核，原核生物的DNA连续接受来自细胞质的调节信号；因此，蛋白质合成的开关控制常是在转录水平上实现的。,8,真核生物通常是多细胞（酵母、藻类和原生动物除外）、结构更复杂、较大的生物。细胞分化尤其需要特定类型的调节。例如，在一个胚胎中，一个细胞不仅需产生新一代细胞，而且也需经历许多相当大的形态的和生化的变化，并需无限维持这些变化。这类永久开关需要在细胞中运用其他调节策略，例如基因丢失、基因失活、基因扩增和基因重排。哺乳动物代谢则是通过营养基质和激素在遗
4、传水平进行调控的。,9,图中：1.可溶性营养物质或代谢产物的跨膜输送；2.代谢途径的酶的催化作用；3.酶和载体蛋白的合成。,1.原核生物细胞的代谢调节部位,10,1.1 与细胞质膜密切相关的调节：主要包括以下4个方面：膜的脂质（磷脂及其它脂类）的分子结构，以及环境（如离子强度、温度、pH等）对膜脂质理化性质的影响；膜蛋白质（如酶、载体蛋白、电子传递链的成员及其它蛋白质）的绝对数量及其活性的调节；跨膜的电化学梯度（膜的生理状态）以及胞内ATP、ADP、AMP库和Pi浓度对溶质输送的调节；细胞壁结构特别是骨架结构的部分破坏或变形，间接影响膜（膜的物理状态）对溶质的通透性。,11,1.2 酶催化能力
5、的调节：也就是细胞空间内存在的酶分子的数量及其活性的调节。在原核细胞中，各种酶和各种底物同存在于一个空间中。处在一定环境和生理条件下的原核细胞中，哪些底物受哪些酶催化，以什么速度进行反应，均受到严格的自动调节。自动调节包括两个方面：一是调节反应途径中的酶水平（酶分子的浓度），特别是关键酶合成或降解的相对速率，二是改变已存在的酶的活力，特别是关键酶的活力。,12,1.3 酶与底物的相对位置：原核细胞内没有典型的细胞器，除了细胞质膜上存在一些凹陷、皱褶外，细胞内不存在被膜分隔的多个空间，在原核细胞中，当一个酶反应系统以多酶复合体（multienzyme complex）的形式存在时，就可以使酶反应
6、在一定空间范围内按特定顺序进行。,13,图中：1.可溶性营养物质或代谢产物的跨膜输送；2.代谢途径中酶的催化作用；3.在核中进行的转录；4.在细胞质中进行的翻译；5.不同细胞空间溶质的跨膜输送。,2.真核微生物细胞的代谢调节部位,14,真核微生物细胞内的空间被膜结构分隔成许多小室。由于这些小室的存在，真核微生物的代谢调节要比原核生物复杂得多。真核微生物细胞同样存在前述原核生物细胞的 3 个代谢调节部位。但第三个调节部位，即酶与底物的相对位置，则因分隔小室而增加了不少调节的内容。小室是使合成代谢和分解代谢能够分开进行和分开调节的重要辅助手段。其中，细胞质与线粒体之间的分工协作，可从 下表中得到反
7、映。,真核微生物细胞比原核微生物细胞的代谢调节复杂而多样化,15,16,二、微生物酶（蛋白质）的自动调节 1 转录水平上的调节 2 翻译水平上的调节 3 蛋白质水平上的调节 4 整个细胞水平上的调节(全局性调节),17,1.转录水平上的调节,1.1酶的诱导的机制 1.2营养阻遏的机制 1.3终端产物对其自身合成途径的酶系的 合成的反馈阻遏和弱化的机制1.4中心代谢途径的酶合成的调节,1.1 酶的诱导(induction)的机制,诱导酶的诱导合成模型（负控诱导）I，诱导酶的调节基因；P，启动子；O，操纵基因；S1、S2、S3，大肠杆菌乳糖操纵子的3个结构基因。,诱导的本质是解阻遏。诱导物与阻遏蛋
8、白的结合是可逆的，调节可以双向进行。,19,研究诱导模型给人们的启迪是：从诱导模型分析，若调节基因I、启动基因P、操纵基因O上发生突变，都可能影响酶的正常诱导。如果启动基因P缺失，则RNA多聚酶无法结合到操纵子上去，不管有无诱导物，转录都不会进行，这种突变株称超阻遏突变株。如果操纵基因O缺失，则不管有没有诱导物，操纵子都不会受阻塞，不需诱导也能使结构基因转录并翻译，这种突变株就是组成型突变株。这两种突变株在工业上都可能得到应用，特别是在微生物酶制剂工业上。,20,1.2 营养阻遏(nutritional repression)的机制,在用混合碳源培养大肠杆菌的研究中发现，细胞中只有一个碳源降解
9、酶系在起作用，也就是培养基中能被最迅速地同化的碳源的降解酶系，而且，在该碳源用完之前，其它碳源的降解酶系的合成一直受到阻遏。这种现象也称为分解代谢物阻遏（最早发现葡萄糖有此阻遏效应，故又称为葡萄糖效应）。,21,典型实例：葡萄糖对乳糖利用的影响。研究证明大肠杆菌的碳源阻遏与细胞中 cAMP水平（即浓度）有关。乳糖操纵子的转录不但需要有诱导物，还需要cAMP（下图所示）。cAMP与一种称为分解物激活蛋白CAP（环腺苷酸接受蛋白）形成复合物，才能与启动子 P 结合而刺激转录（提高RNA聚合酶与P的亲合性）。葡萄糖的利用导致胞内 cAMP浓度大幅度下降，RNA聚合酶不能与P 结合，转录即不能进行。因
10、此，营养阻遏实际上是cAMP缺少的结果。,大肠杆菌中由葡萄糖引起的碳源阻遏模型,（a）启动基因P受到CPA-cAMP 复合物的激活，RNA聚合酶结合到P上；（b）启动基因P没有被激活，RNA聚合酶不能与P结合。图中：P-III【A】表示P-III对酶的激活作用。,23,营养阻遏的意义：微生物细胞在其所处的环境条件下，利用其细胞中已有的酶系首先降解最易利用的生长底物，必要时才会去合成用于降解另一种生长底物的酶系，体现了细胞运作的经济性和自我保障机制。,24,微生物调节合成代谢的酶的水平（即胞内酶分子的数量或酶浓度），使之与所需要合成的产物的量相协调。这种调节依赖终端产物的反馈阻遏、弱化等机制，或
11、两者兼用。这些自动调节机制可以节约细胞内的原料和能量。,1.3终端产物对其自身合成途径的酶系合成的反馈阻遏（repression）和弱化(attenuation)机制,25,许多氨基酸生物合成途径不但受该氨基酸本身的调节，而且受其对应的氨基酰 tRNA 的调节。前者为反馈阻遏，即氨基酸合成途径的终端产物作为辅阻遏物阻碍转录的开始；后者是指称为“弱化”的另一种类型的控制，这种控制涉及到与合成途径的终端产物氨基酸相对应的氨基酰 tRNA 和转录的中止，即当细胞中存在过量的对应氨基酰 tRNA 时，已发动的转录会在操纵子的第一个结构基因被转录前中止。,反馈阻遏控制转录的开始弱化机制控制转录的中止,2
12、6,酶合成的反馈阻遏模型R，酶阻遏的调节基因；P，启动子；O，操纵基因；S1、S2、S3为生物合成途径的酶的结构基因。,反馈阻遏：,27,如果对应于合成途径的操纵子的操纵基因发生突变或调节基因发生突变，使操纵基因的阻塞无法实现，这种解除了调节的突变株可以过量合成相关途径的酶或终产物。这样的突变株叫做调节突变株，可在工业生产上得到应用。,28,2.翻译水平上的调节,包括两层意思：其一是对翻译速度的调节；其二是对已翻译错了的、会成为细胞代谢包袱的蛋白质分子的破坏性降解，即异常蛋白的降解。,29,2.1 翻译速度的控制 一般情况下，翻译速度的调节可以通过调节以下任何一项来实现：蛋白质合成的总速率；翻
13、译起始的概率；mRNA的稳定性。,30,蛋白质合成总速率的调节 翻译的调节发生在为核糖体蛋白编码的几个操纵子上。,有两种反馈调节机制：a)核糖体反馈调节：当核糖体合成少许过量时，游离的、非翻译状态的核糖体抑制rRNA的合成；b)翻译阻遏（translational repression）：某些核糖体蛋白质抑制某些编码一种或多种核糖体蛋白质的 mRNA 的翻译。,31,翻译起始的概率的调节 某些酶的遗传控制也能够发生在翻译水平，被称为转录后的调节。这种调节机制用来控制一个完整的mRNA分子被翻译的次数。,32,2.2 异常蛋白质的降解 异常蛋白质通常是指在胞内并不能累积到它们对应的正常蛋白质的水
14、平（浓度）的蛋白质，异常蛋白质的降解与营养的供应无关，即使在微生物迅速生长时也会发生。这些异常蛋白质包括：由无意义突变引起的不完全蛋白质；发生了氨基酸替代的完全蛋白质；过量合成的多聚复合物大分子的某些亚基（如亚基）。,33,微生物细胞中似乎存在一个专门用来降解异常蛋白的蛋白质降解系统，它主要在大多数异常蛋白质的降解中起作用。对异常蛋白质的及时降解，既可以卸除代谢的包袱，又可以使氨基酸及时得到回用，因此是微生物的一种节约机制。,34,蛋白质水平的调节主要包括：1.变构蛋白和变构酶的调节2.共价调节酶的调节；3.中心代谢途径的酶活性调节；4.合成代谢途径（即代谢网络中离心途径）的 酶活性的调节；5
15、.能荷调节。,3.蛋白质水平上的调节,35,在细胞的生命活动中，细胞的蛋白质可以是酶、载体蛋白、电子传递链成员、调节蛋白（原阻遏物、阻遏蛋白、受体蛋白等）等功能性蛋白和各种各样的结构蛋白。以上蛋白质有相当部分属于变构蛋白和变构酶，另一些蛋白质不是变构蛋白和变构酶，但它们都可以接受蛋白质水平上的调节。,36,蛋白质水平上的调节是指对已存在于细胞中的酶（蛋白质）分子的活性的调节。这些调节包括可逆的和不可逆的调节，实质上是影响总的可利用酶分子中表现活性的酶分子的数量。这些调节能在极短的（调节酶的）特性时间里迅速地得到响应，因为这种调节是通过影响蛋白质（酶）分子构象的变化来实现的。,37,3.1 变构
16、蛋白和变构酶的调节机制 不论是酶合成的调节还是酶的活性的调节，均由效应物（往往是低分子质量的化合物）的介入而引起。这些低分子质量化合物可以来自环境，也可以是细胞代谢的中间产物。这两种调节机制均涉及到一类特殊的蛋白质变构蛋白。,38,变构蛋白是这样一类蛋白质：如果某特定的小分子（效应物）与它结合，它的构象就会发生变化，由此而引起活性的变化。因为这种结合（非共价结合）是可逆的，所以变构蛋白就能在代谢调节中直接地或间接地发生作用。根据变构蛋白的性质和作用，可以把它们分成两类：非酶变构蛋白和变构酶。,39,非酶变构蛋白：主要包括调节蛋白和受控载体蛋白。由调节基因编码，在操纵子表达中起调节作用的变构蛋白
17、叫调节蛋白（如诱导和阻遏模型中的阻遏蛋白和原阻遏物）。当它们处于活性构象状态时，就能与操纵子上相应部位相结合，从而阻塞（或促进）操纵子的转录。,作为输送工具的载体蛋白，有些也是变构蛋白，称为受控载体蛋白。例如大肠杆菌中，由乳糖操纵子的结构基因编码的乳糖透性酶（一种载体蛋白，用于乳糖输送）就是这种变构蛋白。,40,变构酶：变构酶在代谢调节中起重要作用的酶，它们往往是代谢网络中分支途径的第一个酶。变构酶以低聚体（oligomer）的形式存在，可由2、4、6 或更多亚单位组成，这些亚单位可以是相同的多肽，也可以是不同的多肽。在代谢调节中起重要作用的调节酶属于变构酶。,41,调节酶的亚单位除了有活性部
18、位之处，还有调节部位（也称变构部位），这个部位是独立于活性部位之外的、另一与配位体（1igand）结合的部位。活性部位的配位体是酶的底物，而调节部位的配位体一般是效应物（激活剂或抑制剂）。效应物与酶的底物在结构上一般有差异（但有时底物本身就是酶的激活剂）。效应物结合到调节部位上可引起活性部位构象的改变，这种改变或是增强酶的催化活力（激活），或是降低酶的催化活力（抑制）。,42,可由共价修饰引起酶活性（有时还涉及调节特性）改变的酶叫共价调节酶。共价调节酶可以在另外一个酶（修饰酶）的催化下被共价地修饰，即在它分子上共价地结合上或者释放一个低分子量基团，从而使酶的活性（有时还涉及调节性能）发生变化。
19、共价调节酶的好处在于：只要微生物细胞内某个代谢产物的浓度有相对小的变化，就能诱发由这个代谢产物控制的共价调节酶的充分的激活或完全失活（或几乎完全失活）。,3.2 共价调节酶,43,例如：大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的依赖NADP+的异柠檬酸脱氢酶（ID）受到磷酸化和脱磷酸化作用的调节。将醋酸添加到一含葡萄糖很少的培养基中，正在培养中的这两种细菌的异柠檬酸脱氢酶（ID）迅速失活。原因是ID被磷酸化了：ID是TCA环和GOA 环两者分叉处（异柠檬酸节点）的酶，ID 的失活可使更多的碳架物质经异柠檬酸裂合酶（IL）进入 GOA 环，有利于草酰乙酸和磷酸烯醇式丙酮酸（可用于葡萄糖异生成方向）的形成，进而形
20、成糖的磷酸酯，参与细胞壁多糖、DNA、RNA等的合成。,44,分解代谢和中心代谢途径运行可为细胞进行生物合成提供能量和原料，因此把能量代谢的最终产物（以ATP为代表）和用作合成代谢前体的中心代谢途径的某些中间代谢物，作为控制中心代谢途径的调节信号（效应物）是合乎情理的。,3.3 中心代谢途径的酶的活性的调节,45,表4-4概括了大肠杆菌中涉及中心代谢途径(central metabolic pathway)的一些变构酶及它们对应的抑制剂和激活物：,46,细胞内 NADH 浓度的上升就是呼吸链已经被 NADH 饱和的信号，也是 TCA 环运转即将减弱的信号。丙酮酸脱氢酶（PDH）复合物、柠檬酸合
21、成酶（CS），苹果酸脱氢酶（MD）受到 NADH的抑制，CS还受到-KG的抑制，PDH 复合物还受到AcCoA的抑制。,47,F-1,6-2P（即FDP）是酵解和糖原合成途径的关键分支点，它在细胞内的浓度是受到调节控制的。AMP 浓度的上升（ATP缺乏的信号）会抑制糖原的形成，因为ADP-Glc焦磷酸化酶和果糖二磷酸酯酶受到AMP抑制。过量的糖将导致 FDP浓度的上升，这将促进酵解，因为PK和PEPC受FDP激活（前体激活）。胞内PEP的高浓度是胞内有充足的 ATP 供应的信号，其结果是PFK受抑制；同时，激活ADP-Glc焦磷酸化酶，促进糖原的合成。,48,3.4 离心（合成代谢）途径的酶活
22、性的调节 离心途径从代谢前体物出发，经离心途径合成典型的工业发酵的目的产物，或者从离心途径的某中间代谢物分出的合成另一种目的产物的二级离心途径。离心途径中的关键酶，就是该途径中最重要的调控点；而催化这个关键反应的酶往往是分支后面的第一个不可逆反应的酶。这里将从酶的角度分析合成代谢途径的调节情况（图4-13）。,49,图4-13 大肠杆菌中天冬氨酸族氨基酸合成代谢的调节机制的示意图I，抑制；R，阻遏；下标罗马数字表示不同的同工酶。,50,Lys、Thr协同反馈抑制AK。,51,变构酶对合成代谢途径的调节：合成代谢途径的终端产物的反馈调节有很大可能是借助变构酶实现的反馈抑制作用，也就是说，若是有分
23、支的途径的话，分支点后的第一个酶往往是变构酶（调节酶），而终产物则是这个调节酶的效应物。变构酶的活力及该酶所在分支途径上的代谢通量受该分支途径的终产物的浓度控制。,52,共价调节酶对合成代谢途径的调节：如果共价调节酶催化分支代谢途径的关键反应，就可以满意地调节这条分支途径的代谢通量。好处是：某代谢产物浓度的相对小的变化，就能诱发由这个代谢产物控制的共价调节酶的充分激活或失活。,53,同工酶对合成代谢途径的调节：在有分枝的合成代谢途径中，其共同途径的第一个酶可能是同工酶。比如大肠杆菌的 Asp 族氨基酸的合成途径是有 3 个分支的途径，在这一族氨基酸的合成代谢途径上，天冬氨酸激酶（AK）和高丝氨
24、酸脱氢酶（HD）分别由 3 个和 2 个同工酶组成。,同工酶是生物体对环境变化或代谢变化的另一种有利的调节方式。当其中一种同工酶受到抑制或缺损时，另外的同工酶仍在起作用，从而保证微生物细胞的代谢继续进行。,54,图4-13 大肠杆菌中天冬氨酸族氨基酸合成代谢的调节机制的示意图I，抑制；R，阻遏；下标罗马数字表示不同的同工酶。,55,多功能酶对合成代谢的调节：从图4-13 可以看到，在大肠杆菌中AK 和HD都是同工酶。研究结果证明，AK和HD酶分子由 4 个亚基组成，2个酶的活性中心同在1 个亚基上，亚基多肽链的N 端是AK，C 端是HD，也就是说 AK 和 HD 同存在于一条多肽链上，AK和H
25、D构成一个多功能酶。,56,能荷（energy charge）的调节 降解代谢确实受到了反馈调节。什么是糖代谢的、可以被看作效应物的“终产物”呢?,可以把ATP视为糖分解代谢的“终产物”，这样就可以用反馈抑制的机制来解释 ATP 过量时对糖的分解代谢途径的抑制，以及当ATP分解为 ADP 或AMP时上述反馈抑制被解除的现象。,57,因为腺苷酸借助载体蛋白跨膜传递的比例是11，所以，真核微生物细胞的线粒体或原核细胞的腺苷酸库（包含AMP、ADP、ATP）基本稳定；但细胞或线粒体内 ATP、ADP、AMP 分子数的比例则随着细胞的代谢生理状态而变化。ATP、ADP、AMP 分子数的比例反映了细胞的
26、能量状态。,58,为了衡量细胞的能量状态，Atkinson设定了一个能表示细胞能量状态的参数，并把这个参数叫做能荷（energy charge）。,上式给出的能荷对流量的协调控制，式中带下标的c分别表示下标对应的腺苷酸的浓度。,59,从上述推导过程可看到，能荷即ATP、ADP、AMP体系中高能键负荷的度量，其数值在01。一般说来，高能荷抑制补充代谢能的酶系，同时激活消耗 ATP的酶系，例如生物合成酶系；反之低能荷则抑制消耗代谢能的酶系，同时激活生成ATP的酶系。,巴斯德效应是能荷调节的一个典型实例。,60,4.整个细胞水平上的调节(全局性调节)作为基因调节的一个例子，乳糖操纵子的调节机制的揭示
27、，激起了研究其他操纵子的强烈兴趣，导致很多新操纵子的发现。对这些操纵子的系统的研究和分析的过程中，形成了一个共识：操纵子并不是孤立地起作用，而是作为高水平调节网络的成员发挥作用。,61,例：大肠杆菌具有在下列各种环境条件下生长和生存的能力：从营养丰富的培养基转入基本培养基；改变碳源；氨基酸供应受限制；供氧与缺氧环境间的转换（仅对兼性微生物）；热刺激（培养温度突然升高）；细胞饥饿的环境条件（如磷酸盐、氮和碳源）。细胞经受所有以上这些外界压迫（stresses），仍能在DNA复制、细胞生长和分裂之间维持所需的平衡。把涉及细胞生理学的单方面调节纳入对环境压迫协调响应中去的控制方式称作全局控制(glo
28、bal contro1)。,62,全局调节网络,全局控制（global control）是整个细胞水平的调节。全局控制是细胞利用调节信号的与生俱来的能力。细胞利用调节信号控制细胞生理学的诸多方面，并对前述的任何一种环境变化做出协调响应。,63,以研究的细菌代谢的全局控制的机制有：SOS响应网络（可诱导的修复）；热刺激响应；有氧及无氧激励子；紧缩响应。此外还有氮同化和氮固定的调节、受磷酸盐饥饿控制的激励子的调节，以及蛋白质分解的控制（即Lon 蛋白酶）的调节等。,64,三、代谢网络中碳架物质流的调动,处于一定环境条件下的微生物培养物中，参与代谢的物质在代谢途径（网络）中按一定规律流动，形成微生物
29、代谢的物质流。,代谢物质的流动过程是一种类似“流体流动”的过程，它具备流动的一切属性，诸如 方向性、连续性、有序性、可调性等等，并且可以接受疏导、阻塞、分流、汇流等“治理”，也可能发生“干枯”和“溢出(泛滥)”等现象。此外，还有流速和流量等问题。,65,微生物代谢途经的变动性和可调节性，不但是代谢流飘移的内在原因，而且也是人工控制代谢流的生物学根据。工业发酵中，人的主观能动作用表现在对代谢流的治理上。治理的直接的目的是让微生物细胞过量合成（overproduction）人们所需要的代谢产物。,66,1.过量合成和微生物的异常代谢 野生菌株在它们天然栖息地在其生长或维持，需要时也能合成人们所希望
30、的代谢产物，但在其固有的代谢调节机制的控制下合成的量不多不少，只够细胞自身生长或维持的需要。体现了微生物细胞的经济性。,67,适用于发酵生产的微生物必须具有过量合成的能力，也就是说是其目的产物的合成量必须大大高于它通常的合成量。要做到这一点，不仅要求合成目的产物的途径畅通，还必须有将目的产物排出细胞的满意的机制。过量合成的速率取决于微生物的遗传性能，以及在培养条件下细胞的生理状态。,68,微生物过量合成目的产物（特定的代谢中间产物）的过程，实质上是功能残缺或遗传失常的微生物细胞在人为的特定条件下进行异常代谢的过程。因此，研究微生物过量合成指定的初级代谢产物的机理，就是研究工业微生物的病理学。,
31、69,微生物排出某些能量代谢副产物的过程，实质上是兼性厌氧微生物在环境条件逼迫下（如缺氧），变通地维持生计的过程。兼性厌氧微生物细胞在缺氧条件下，以变通的方式实现还原力的平衡和辅酶的再生和回用，使细胞的能量代谢得以维持，与此同时形成并分泌出能量代谢副产物。例如酿酒酵母在发酵液中累积能量代谢副产物乙醇的过程，就是这样的过程。,70,2.溢出代谢 发生溢出代谢（overflow metabolism）的原因是，代谢途径前段的运转速率大于后段的运转速率。采用改变环境条件或限制营养供应等方法，可促使微生物进行溢出代谢。有两个溢出代谢的实例：TCA环中间产物柠檬酸的溢出代谢导致能量代谢的副产物乙醇生成的
32、溢出代谢,71,（1）柠檬酸的溢出代谢：多种微生物均能因受激而过量合成柠檬酸。研究柠檬酸溢出代谢的最好的例子无疑是黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定环境条件下累积柠檬酸，是因为在这种环境条件下代谢途径前段的运转速率大于后段的运转速率。柠檬酸的溢出代谢是黑曲霉特有的遗传和生化机制与培养条件共同起作用的结果。引起溢出代谢的原因包括以下三个方面：,72,Glc,G-6-P,(PFK),CTA,NH4,I,+,A,FDP,PYR,OAA,AcCoA,CTA,(CS),(KD),黑曲霉中柠檬酸的代谢溢出,73,高水平的柠檬酸合成能力。这个能力由 3 个因素构成：第一是在有高浓度草酰乙酸（OAA）的情况下对 A
33、cCoA 具有高度亲和力的组成型的柠檬酸合成酶（CS）的存在；第二是催化丙酮酸（PYR）固定 CO2 生成草酰乙酸反应的高水平的组成型的丙酮酸羧化酶（PC）的存在；第三是在缺少锰的条件下，蛋白质分解或蛋白质合成受阻造成的铵的高浓度能解除柠檬酸（CTA）对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。此外，柠檬酸的分泌降低其胞内浓度。,74,较低的降解柠檬酸的能力。这能力由两个因素构成：第一是低水平的-酮戊二酸脱氢酶（KD）影响 TCA环运行的畅通程度，使TCA环前半部的中间产物积压；第二是在锰缺乏的条件下，顺乌头酸酶（AE）和 异柠檬酸脱氢酶（ID）的活性降低，从而使柠檬酸的累积比其它几种酸（顺乌头酸、异柠檬
34、酸和-酮戊二酸）更明显。,75,柠檬酸的排出。在柠檬酸过量合成阶段，培养基的 pH 值显然会影响细胞膜对目的产物柠檬酸和的跨膜输送；柠檬酸的分泌也会影响培养基的 pH 值。锰与铁的缺乏有利于柠檬酸的排出。,76,乙醇的溢出代谢：人们逐步认识到，酿酒酵母之所以在葡萄糖培养基中累积乙醇，是因为该微生物有限的呼吸能力，并把这种现象称为瓶颈效应（bottleneck effect）。,77,在供氧情况下，酿酒酵母细胞中葡萄糖主要经 EMP-TCA 途径（少量经HMP途径）氧化降解。这些途径中形成的NADH和FADH2分子上的电子需经电子传递链（呼吸链）传递给分子氧。当葡萄糖浓度较低时，葡萄糖氧化降解过
35、程所需配套的电子传递能力处于电子传递链传递能力范围以内，这时氧的吸收速率与细胞的生长速率成线性关系。辅酶NADH 和辅基 FADH2 完全可以在电子传递链释放电子而得到再生。,78,当葡萄糖的浓度超过某值，葡萄糖氧化降解过程所需配套的电子传递能力超越微生物细胞电子传递链传递能力范围，细胞并不会因为葡萄糖的高速消耗而附带地形成足够高的呼吸能力（指呼吸链使NADH再生的能力）与之配套；一部分NADH不能通过电子传递链而再生成 NAD+，只好将电子交给内源的有机化合物乙醛，将乙醛还原成乙醇，从而实现还原力的平衡。而且葡萄糖的异生途径因受到高浓度葡萄糖的调节而受阻，更加强了瓶颈效应。从而导致生成乙醇的
36、溢出代谢。,79,从以上实例可以看到，溢出代谢的发生，不但要求微生物本身具有相应的遗传根据，还必须具备相应的环境条件。对于工业发酵来说，就是特定的生产菌种和与其对应的生产工艺条件。,由此可见，乙醇的溢出代谢实际上是细胞内生物氧化过程中形成的还原力相对于电子传递链的呼吸能力的溢出，推动了乙醛还原生成乙醇的发酵过程。,80,3.代谢流“治理”的可能性和现实性 代谢流具有流体流动的基本属性，因此具有“治理”的可能性；微生物代谢的变动性和微生物遗传的保守性，加上人的主观能动性，能使可能变为现实。,81,3.1 初级代谢产物过量合成的五字策略,用于设计育种以及发酵工艺控制的五字策略（简称工业发酵的五字策
37、略）：进、通、节、堵、出“五字策略”就是从合作的良好愿望出发，发挥人的主观能动作用，主动与微生物合作实现工业发酵效益的策略。这个策略来自初级代谢产物过量合成的研究，故实际上是初级代谢产物过量合成的五字策略。,82,工业发酵的“五字策略”,83,进：在育种和发酵控制方面都要促进细胞对营养物质的吸收。在发酵过程中，一般都希望菌体能迅速达到一定的浓度，因此，就必需选用生长旺盛的菌株，这类菌株吸收营养物质的能力往往也较强。同时要选择适当的容易吸收的培养基，和适宜的培养条件，以促进微生物的生长。为了消除底物在培养过程中的抑制作用，有的还采用流加的培养方法。为了促进微生物的生长和支持目的产物的合成，还要从
38、代谢生理学的角度优化流加条件。,84,通：在育种方面，解除对途径中某些酶的反馈调节；在发酵控制方面，诱导这些酶的合成或激活这些酶，从而使来自各代谢物流（除碳架物流外还包括其他支持生物合成的物流）能够畅通地注入载流路径，汇入代谢主流，流向目的产物。特别是当发酵进入目的产物合成阶段后，必需确保载流路径畅通，代谢主流优势明显。,85,这些酶包括用于目的产物自身合成的酶（如下图中酶）和用于目的产物的前体合成的酶（如下图中酶和，用于前体C的合成，酶，用于前体D的合成）。,86,例如：在谷氨酸的发酵过程中，作为谷氨酸合成原料的 NH4+的缺乏，就可能使谷氨酸合成途径的中断，导致谷氨酸产量下降，大量-酮戊二
39、酸积累。当然，合成途径中的任何一个限制因子，都可能产生类似的情况。因此，在发酵过程中应尽可能的使通向载流路径的代谢途径畅通无阻，使不同的营养物质能顺利地注入代谢主流，最终流向目的产物。,87,节：采用育种或发酵控制手段，节制载流路径上与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物。,这里所谓的“节制”是指封闭或削弱以目的产物合成途径的起始底物（如图中的A）或各中间产物（如图中的B、C 和D）为起始底物的分支途径（即图中通向 K，G，I，J 的途径）。,88,堵：采用育种或发酵控制手段堵塞或削弱目的产物进一步代谢的途径（如上图中 F 以后的途径），包括目的产物参与的分
40、解代谢和合成代谢。如果菌株生产目的产物的途径畅通，但同时目的产物进一步代谢（包括目的产物参与的分解代谢和合成代谢）的途径也畅通，或者随着生产的进行目的产物进一步的代谢加强，都会最终影响目的产物的溢出代谢，降低工业发酵的效益。,89,为了消除这种影响，就必须降低目的产物进一步代谢的酶的酶活力或酶量，以消除或削弱目的产物进一步的代谢。若不能对菌株进行有效的改造，也可以通过工艺手段来达到堵的目的。例如，采用及时将目的产物从发酵液的分离出来的办法，也可以间接地消除或削弱胞内目的产物的进一步代谢，甚至能拉动溢出代谢。,90,出：促进目的产物向胞外空间分泌。,在育种和发酵控制方面加强“出”的办法很多，如调
41、节细胞对目的产物的通透性；增加输送目的产物的载体蛋白的量；为目的产物的主动输送提供代谢能等，都能使在胞内生成的目的产物尽快的转移出细胞，降低其细胞中的浓度。为了进一步降低细胞中目的产物的浓度，还可能根据目的产物的理化性质，采用边发酵边分离目的产物的工艺，不断地将目的产物从反应器中转移出去，给代谢主流一个“拉动力”。,91,3.2 有关代谢途径的流量调节的分析 以天冬氨酸族氨基酸的合成代谢为例，来讨论代谢途径的流量调节。对细菌来说，天门冬氨酸族氨基酸包括Asp、Asn、Lys、The、Ile 和 Met 共6 种氨基酸（或氨基酰胺），它们都是从 TCA 环中的前体代谢物草酰乙酸（OAA）开始合成
42、的。,92,微生物细胞以葡萄糖为原料合成天冬氨酸族氨基酸时，碳架物质通过代谢网络的载流路径流向目的产物，其载流路径的上游部分从葡萄糖起到草酰乙酸止，草酰乙酸以后为下游部分。其上游部分属于中心途径，下游部分属于离心途径。因此天冬氨酸族氨基酸合成代谢流是跨代谢网络的中心板块和离心板块的。关于天冬氨酸族氨基酸的合成代谢路线（下游部分）及其调节方式总在下面几张图中：,93,94,95,96,下面是乳糖发酵短杆菌的Lys高产菌株的设计育种示意图。绿色箭头连接成的路径为以葡萄糖为主要碳源时的理想载流路径。所谓“理想载流路径”是指为了获得高效益，人们期望代谢流流经的路径。,98,“五字策略”的实施：“节”的
43、成功实施：若以黄色短杆菌为出发菌株，选育 L-Lys 高产菌种，可采用高丝氨酸营养缺陷型突变株。假设高丝氨酸营养缺陷是因为高丝氨酸脱氢酶（HD）缺损而造成的，从前面对应的图可找出造成 L-Lys高产的原因：阻止碳架物质 Asp-SA 流向H-Ser；解除 Thr、Lys对天门冬氨酸激酶（AK）的协同反馈抑制（因为细胞不能合成Thr）；省下原用于11e合成的PYR，以支持Lys合成。,99,“通”的实施：赖氨酸的结构类似物S-（-aminoethyl）-L-Cys，简称 AEC，是最早用于氨基酸育种并取得明显效果的结构类似物。在黄色短杆菌的亮氨酸缺陷型突变株 Leu-上再加上结构类似物抗性标记（
44、AEC+Thr）r 后Lys产量大幅度上升，这是因为这个突变株已解除了Lys和Thr对天门冬氨酸激酶（AK）的协同反馈抑制，是个调节突变株。关于“进”、“出”、“堵”的策略应用也都有成功的实例。,100,微生物的适应性和节约性建立在代谢变动性上，微生物的持续代谢建立在代谢网络的刚性上。因此代谢变动性和代谢网络的刚性是细胞经济管理原则的生物学根据。,工业生产过程中细胞机器的经济运行状况可以改变，但细胞的“整体协调，维持生计”的细胞经济管理原则不会改变。,小 结,101,细胞经济假说是理解发酵工程的基本矛盾（人与微生物的对立统一关系）、以及发酵工业上人与微生物合作关系的理论基础。人与微生物合作并取得“双赢”意味着工业发酵的成功，“双赢”也必须建立在细胞经济管理原则（细胞经济规律）之基础上。,102,思 考 题1.把微生物活细胞当作经济实体来研究是否有道理？是否可行？2.为什么微生物细胞机器的价值取向与微生物细胞自身的价值取向不一致？3.什么是“五字策略”？为什么“五字策略”有时不能尽如人愿？4.讨论：工业生产中应该怎样去协调人的经济利益与微生物细胞的生存利益？,
