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1、第17章核酸结合蛋白,基本概念和定义,蛋白和核酸的相互作用主要可分为四类：（1）即结构和包装作用（如组蛋白、病毒衣壳蛋 白等）；（2）运输和定位作用（tRNA,mRNA和核糖体结合）；（3）代谢和重排作用（如DNA和RNA聚合酶、核酸 酶、解旋酶等）；（4）基因表达作用（如RNA聚合酶、转录因子、核 糖体和起始因子等）。值得注意的是：对于特定蛋白而言，其功能并 不是唯一的。,根据底物的特殊性，核酸结合蛋白可分为三类：（1）非特异性结合蛋白；（2）序列特异性结合蛋白；（3）结合特殊结构的蛋白（如在DNA中的不正常碱基，重组中间体，以及核内含子套索）。大部分核酸结合蛋白在一个内部位点以定位方式相互
2、作用。用于蛋白和核酸识别的非共价键主要包括（1）静电吸引和氢键，（2）主链连接，（3）氢键和碱基连接。同时，在相互作用时，蛋白和核酸的构象常常发生改变，以产生最大的互补作用表面。,一.核酸被蛋白识别,（一）DNA识别的一般方式1、识别基础：DNA结合蛋白识别整个螺旋分子的几何结构，通过接触大沟或小沟，连接核糖磷酸主链或 碱基同DNA相互作用。2、同dsDNA结合的蛋白（1）同DNA末端相互作用的蛋白（如DNA连接酶，外 切酶）；（2）围绕DNA或以深的狭缝结合DNA的蛋白（DNA聚 合酶，拓扑异构酶）；（3）同DNA双螺旋表面作用的蛋白（如转录因子）。,(二)RNA识别的一般方式 1、识别基础
3、：（1）一级序列（如SD序列，加尾序列）（2）RNA折叠形成的高级结构：二级结构(突起，发夹，茎环)如著录 终止，tRNA的加工，内含子剪切等 三级结构（三股螺旋，tRNA的L-形结构）如aa-tRNA和氨酰合成酶的结合。2、RNA结合蛋白的特征（1)局部形成方式同RNA相互作用；（2）折叠常用于相互识别的表面,凸起：双螺旋的一条链上有单个碱基多余时出现的结构凸环：双螺旋的一条链上有多于一个碱基多余时出现的结构内部环：双链结构中由于一个或多个碱基错配形成的畸形结构发夹/茎环结构：具有不完善的两侧对称结构的区域形成的二级结构，两段互补的序列可形成茎干，完全互补时形成的结构称为发夹，一端有未配对的
4、碱基时形成茎环结构或发夹环结构柄环结构：一段独立的核酸序列，末端形成一小段互补配对的结构，其余部分形成环十字型结构：具有回文序列的双链核酸中，当两条链都可自发形成发夹/茎环结构时可产生十字型结构,大肠杆菌16S rRNA的二级结构,I 类内含子的二级结构,II 类内含子的二级结构,植物病毒和类病毒,类病毒（viroids）感染性RNA分子，独自具有功能，外面不包被任何蛋白外壳。拟病毒（virusoids）与此结构相同。但包被在植物病毒内。拟病毒本身不能复制，必须依赖病毒的帮助，这种拟病毒有时称为卫星RNAs（satellite RNAs）,锤头结含58nt,有3个茎环和13碱基的保守顺序,RN
5、A的三链结构,tRNA的三级结构（L型）：,DNA和RNA结合蛋白中基本的识别结构,缩写：HMG高泳动结构；TAFTBP(TATA结合蛋白)相关因子；BPV牛乳头瘤病毒；RNP核糖核酸蛋白；dsRBD=双链RNA结合蛋白；hnRNP=核内不均一核糖核蛋白,The ribbon-helix-helix motif.,The drawing is of the ribbon-helix-helix motif of the Escherichia coli MetJ repressor,which consists of a dimer of two identical proteins,one
6、shown in blue and the other in green.The-strands at the left of the structure make contact with the major groove of the double helix.N and C indicate the N-and C-termini of the motif,respectively.,带-螺旋螺旋,N,N,C,C,带-螺旋-螺旋模体,二 蛋白中的DNA结合基序,一、螺旋-转角-螺旋模体（HTH motif)这种模体包含有两个螺旋，螺旋之间间隔有一个短的转角，使两个螺旋可通过疏水作用装配起
7、来。第一个螺旋稳定并使第二个螺旋暴露出来，与DNA的大沟作用，而特异性地与碱基接触，第二个螺旋仍被称为识别螺旋(recognition helix)。在很多细菌的调节蛋白中有这种相同的模体存在，如Lac阻遏蛋白,Trp阻遏蛋白、分解代谢激活蛋白(CAP),阻遏蛋白-Cro,的CI蛋白，在酵母中涉及交配型的a1和 a2蛋白。在高等真核中的Oct-1和Oct-2也属于此类型；在果蝇早期胚胎发育中决定体节的一些基因如bicoid编码的蛋白。,Lac阻遏蛋白,Lac阻遏蛋白单体的结构,的CI蛋白,在二聚体的-螺旋和DNA结合的模型中，-螺旋-3单体位于DNA同一面的大沟中，而-螺旋-2横在此大沟上。,
8、识别螺旋顺着DNA大沟排列,分解代谢激活蛋白(CAP),CAP蛋白和DNA结合形成环，阻遏蛋白四聚体和操纵基因结合,Trp阻遏物识别螺旋与大沟垂直,同源异形结构域（Homeodomains，HD）,是一种编码60aa的序列，长180bp，它存在于很多控制果蝇早期发育基因中，在高等生物中也发现了相关基序。HD的C-端区域和原核阻遏蛋白的HTH同源，但也有几点不同:（1）HD的C端由3个-螺旋构成，螺旋3结合于大沟，长17aa；而阻遏蛋白由5个-螺旋构成，螺旋3长仅9个 aa；（2）原核的HTH的以二聚体形式与DNA结合，靶序列是回文结构，而HD是以单体形式与DNA结合，靶序列不是回文结构；（3）
9、HD N-端的臂位于小沟，而HTH螺旋1的末端与DNA的背面接触。,触角足蛋白的同源结构域,POU(pit-1,oct-1,oct-2,和线虫unc-86基因)结构域,由70到75个氨基酸构成，位于许多真核转录因子的同源盒结构域(Homeobox)的上游。POU结构域有两个保守的区域，一个为POU特异结构区域，另一个是POU的同源结构域，两个亚结构域由一个螺旋-转角-螺旋模体作为结合DNA的功能区，同时也参与介导蛋白质-蛋白质间的作用。现在已知，许多转录因子都可和POU结构域发生作用。,POU转录因子,配对功能域（paried domain）：果蝇和脊椎动物的 Pax-配对盒-转录因子含有两个
10、HTH模体。相关蛋白含有第二个HTH模体和一个与Hin重组酶同源的组件，一道组成了独特的配对功能域(paried domain),高泳动蛋白结构域（HMG domain):存在于染色体结构 蛋白和Sry等转录因子中。可和dsDNA的小沟作用，实 际上属于与HTH蛋白不同的DNA结合蛋白家族。,细菌HTH模体的特点（1）识别螺旋的N端负责结合DNA，同源结构域识别螺旋 的中部区域完成结合功能；（2）同源结构域识别螺旋方向保守；（3）同源结构域蛋白的二聚化。,真核生物具有HTH模体的其他功能域,Human PAX-6 paried domain,Human Sry-DNA complex,在包括蚯
11、蚓、昆虫和脊椎动物在內的五门动物中，都存在一组控制眼功能发育的基因叫Pax-6（paired box gene 成对框-6）。,33.17,33.13,二、半胱氨酸-组氨酸锌指1、锌指结构 是第一个被发现的真核细胞中同 DNA结合有关的结构，在细菌中十分少见。2、结构特点：有发夹和一个相邻的螺旋。以一对半胱氨 酸和一对组氨酸在12个氨基酸残基组成的环中和锌离子 配位。环状结构核心序列保守（C-X2-4-C-X2-4-F-X5-L-X2-H-X3-4-H),突出于蛋白表面，顶端碱性残基同DNA分 子大沟作用。,3、多个锌指同DNA结合，有的锌指作为隔离物，不同DNA 直接接触。,锌指（zinc
12、finger）基序,带有Cis/Hi锌指结构的转录因子和DNA结合蛋白,ADR1:酿酒酵母的转录激活蛋白，表达醇脱氢酶ADH2等所需的DNA结合蛋白,典型的锌指蛋白有一组锌指，单个的锌指的保守序列是：Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X2-His,根据锌结合位点的氨基酸又把锌指分成为2Cys/2His和2cys/2cys两类，前者为型，后者为型锌指，型结构“指”的本身由23aa组成，“指”与“指”之间通常由7-8aa连接。,锌指可形成-helix插入大沟，与其相连接的-sheet 在另一侧,糖皮质激素和雌激素受体都有两个“指”，每个指在Cys四分体的中央带有一
13、个锌原子。两个指形成-螺旋，彼此折叠成一个大的球状功能域。-螺旋与螺旋相连的折叠一道形成一个疏水中心。N-端螺旋的一侧和DNA的大沟接触，两个糖皮质激素受体形成二聚体和DNA结合，每个受体负责和连续的大沟接触。每个“指”控制着受体的重要特点。图表明在第一个“指”的右侧控制DNA的结合，在第二指的左侧控制着形成二聚体的能力。,View of the Lac repressor DNA complex,as determined by X-ray crystallography.Here the repressor tetramer is shown binding to two operator
14、s.Each dimer binds to one operator.The operators are 21 base pairs long here and are shown in dark and light blue.The monomers are colored green,pink,red,and yellow.Note how the amino-terminal headpiece on one monomer(pink)crosses the other monomer(green)to bind the first part of the operator,wherea
15、s the second monomer headpiece(green)crosses over to bind the second part of the operator.Thus,the recognition helix from each of two subunits binds to the consecutive parts of the same operator.,爪蟾TFA锌指结构域,经典的锌指结构,三、半胱氨酸锌指1、结构特点：含锌的DNA结合结构域只用半胱氨酸配位锌2、核受体家族的DNA结合结构（1）DNA结合结构为一个包含两相互垂直螺旋的球形结构（2）以二聚体的
16、形式结合DNA,3、锌双核簇：酵母蛋白所特有，由6个半胱氨酸配位2个锌原 子，具有保守序列C-X2-C-X6-C-X6-C-X2-C-X6-C,糖皮质激素受体-DNA复合物,GAL-4的锌双合簇的结构（左：前视图；中：测视图右：俯视图（拉链作为二聚化结构）,四、碱性结合结构域（bZIP及bHLH)亮氨酸拉链（Leucine ziipper）和螺旋-环-螺旋（HLH）1、结构特点：高度碱性的螺旋作为同DNA的基本识别结构，螺旋通常以二聚体的形式存在，二聚化结构域一样为DNA 结合所必需。2、结合机制：碱性结构域在溶液中采用一种无序的部分螺 旋结构，当同DNA结合时，这种结构发生了变化而诱导了 典
17、型螺旋的形成。,C-Jun和C-Fos蛋白的异二聚体的结合比它们同二聚体更为坚固。Myc，C/EBP（结合CAAT box和SV40核心增强子的一种因子），AP1蛋白（异二聚体，结合于SV40的增强子）等都具有亮氨酸拉链结构。,亮氨酸拉链（leucine zipper）结构域通常被定义为一行4-7个周期重复的亮氨酸残基，其距离大约跨越8个螺旋转弯，通式为L-x(6)-L-x(6)-L-x(6)-L，有时典型的亮氨酸残基会被异亮氨酸或缬氨酸所代替。结构分析发现亮氨酸拉链由平行的卷曲螺旋型螺旋（coiled-coil-helix）构成，它们通过亮氨酸侧链的疏水作用互相缠绕。,GCN4二聚体结构 小
18、鼠Max蛋白,螺旋一环一螺旋（HLH，helix-loop-helix）,有一条含有两个亲水的-螺旋,链长为4050 aa，两个-螺旋由很长的连接区（环）相连，螺旋的一侧有疏水氨基酸，两条链依赖疏水氨基酸的相互作用形成同二聚体或异二聚体，此螺旋区长约1516aa，含有各种保守的残基，连接环的长度不等，一般为12-28aa。与DNA结合的是碱性区，长为15 aa，其中有6aa为碱性。在HLH中带有碱性区的肽链称为 碱性HLH（bHLH，proteim）。,bHLH又分为两类：A类是可以广泛表达的蛋白，包括哺乳动物的E12/E47（可和免疫球蛋基因增强子中的元件结合）和果蝇da（daughterl
19、ess,性别控制的总开关基因）的产物；B类是组织特异性表达的蛋白，包括哺乳动物的MyoD(肌浆蛋白（myogen）基因的转录因子)和果蝇的AC-S（achaete-scute 无刚无基因的产物）这种bHLH可能是一种转录调控蛋白，大部分以异二聚体形式存在。,类组蛋白结合模体,五、1、核心组蛋白都有组蛋白折叠这样一个保守的结构，其包含两个介导二聚化的螺旋-链-螺旋结构2、许多转录因子于不同的核心组蛋白同源，如TAFs,类组蛋白结合模体,真核细胞的DNA分子可通过同组蛋白作用被包装成核小体。在核小体的核心颗粒中包含有二个负超螺旋弯曲的DNA围绕着一个组蛋白的八聚体。这个八聚体分别由同样两个核心组蛋
20、白H2A,H2B及H3，H4组成。它们同DNA之间的相互作用涉及DNA中富含AT区域的小沟存在于组蛋白八聚体的表面并将其缠绕。,一级序列揭示：各组蛋白之间仅有很低的同源性(20%)，但是它们具有一个保守的结构，即组蛋白折叠(histone fold)，它包含着由二个介导二聚化的融合的螺旋链螺旋的结构，组蛋白的连接子(如 H1，H5)也在染色体的高度有序化中起作用。,六、其他DNA结合基序1、乳头瘤病毒的E2蛋白包括4个链和一个突出的螺旋，二聚体形成桶状结构,2、通过链识别（1）带-螺旋-螺旋 在MetJ,Are,Mnt中发现，通过折叠 同DNA识别；,（2）TATA结合蛋白 以反平行的链同DN
21、A结合，链结合 DNA的小沟。呈C字型包围DNA,E2 蛋白,带-螺旋-螺旋模体,TBP结构（上为前视图；下为俯视图）,3、The Rel家族Rel同源结构域(RHB)包含由铰链区连接的免疫球蛋白折叠。Rel蛋白有形成二聚化的倾向,4、DNA加工酶中的结合模体催化合成和拓扑修饰的酶以沟状或环状结构围绕DNA，限制性内切酶倾向于使DNA发生剧烈扭曲,17.3 蛋白中RNA结合模体一、RNP结构域1、结构特点：两种保守模体构成更大结构的一部分，大的 结构由4个链和两个螺旋以-的拓扑 结构组成,RNP1和RNP2模体位于一个四条折叠的中心 链处2、代表：U1A剪接体蛋白,二、其他RNA结合模体1、双
22、链RNA-结合结构域：拓扑结构类似于RNP结构域，但同 RNA的特异性结合仅发生于第二个螺旋和折叠形成的 裂缝中2、K同源结构域3、其他,U1剪接体蛋白N-端RNP结构域,17.4 蛋白，核酸结合的分子基础一、核酸与蛋白的直接作用1、核酸蛋白直接作用的途径（1）蛋白侧链同碱基作用序列特异性相互作用的主要 形式；（2）蛋白主链同碱基作用；（3）蛋白侧链同磷酸骨架的作用；（4）蛋白主链同磷酸骨架的作用。2、存在于蛋白和核酸相互作用中的非共价相互作用：氢键、范德华力、疏水作用、静电作用及静电链、核酸自身的 氢键、碱基堆积作用和蛋白氨基酸残基之间的吸引和排 斥二、水在核酸蛋白相互作用中的作用1、负责结
23、合反应的亲和力和特异性2、流动性增加了蛋白结合对接触面突变的适应性,三、核酸结构的蛋白调节1、蛋白通过熔解碱基对，减小或增大弯折或螺旋来改变 DNA的结构。2、限制性内切酶造成最剧烈的扭曲和扭结3、DNA的柔性在转录和染色质结构形成中也有重要的作用四、二聚化和协同性1、二聚化的目的（1）通过增大结合蛋白的大小，增大接触面和碱基识别的 数量；（2）通过增大蛋白同DNA结合的接触面，增加结合的稳定 性；（3）通过可循环的蛋白与蛋白作用，增加作用的亲和力。2、二聚化的优点：通过形成异二聚体增加识别靶位点的范 围，同时在调控中可使用非活性单体增加蛋白作用的多 样性,3、二聚化对于bZIP和bHLH蛋白
24、家族成员的作用（1）功能的多样性可由选择性的二聚化产生，如c-Fos和 c-Jun蛋白（2）调节的多样性可由选择性的二聚化产生，如MyoD1,成肌素，Myf-5和MRF-4的活性调节,17.5 序列特异性结合一、蛋白识别的DNA序列1、直接解读：涉及大沟或小沟处蛋白和碱基之间的相互作 用，蛋白直接识别碱基。2、非直接解读：涉及蛋白和糖、磷酸骨架之间的相互作用，蛋白识别那些造成整个DNA特殊构象的序列。二、DNA中的分子信号:DNA碱基中由一种隐藏在键模式中 的信号。在大沟处，成键基团模式对于每个碱基对是 唯一的，因而在大沟出可以进行明确的序列解读；而 在小沟处，成键模式是简并的，仅存在A/T和
25、G/C之间 的区别,三、解读蛋白中的氨基酸1、结构域交换：在不同的蛋白中进行DNA结合结构域的交 换2、部分结构域交换：可鉴定出DNA结合结构域中控制序列 特异性的某些特定区域,大沟侧,小沟侧,大沟侧,小沟侧,3、结构分析：通过X射线和NMR对蛋白-DNA复合体的结 构进行分析，可以在原子分辨水平上确定分子内键的空 间排列,四、假定的锌指蛋白DNA识别密码1、一般而言，没有一套普遍的密码适用于所有序列特异性 蛋白和DNA的相互作用2、对于一些Cys2His2锌指蛋白而言，它们同DNA的作用特 点简单，总是几个同样的氨基酸链同碱基作用，如Zif2683、Zif268中的保守序列：Pro1(Tyr
26、/Phe)2XCys4XXCys7 XXXPhe11XX13XX15X16Leu17XX19His20XXXHis24,Structure of the first zinc finger of Zif268.Residues 13,15,16 and 19 are implicated in DNA recognition,in this case the base triplet GCG.The zinc ion is in the lower right portion of the structure and is chelated by two cysteines and two h
27、istidines.,五、序列特异性的RNA识别1、RNA在细胞中作用的多样化造成RNA-蛋白复合物结构 的多样化2、氨基酰-tRNA合成酶同底物作用的方式,I类tRNA合成酶与tRNA受体茎的小沟和反密码子环结合,II类tRNA合成酶，在tRNA受体茎的大沟处和反密码子环结合,17.6 研究蛋白核酸相互作用的技术一、同蛋白作用的核苷酸序列的描述,二、同核苷酸作用的蛋白质的纯化方法1、硝酸纤维素层析：利用RNA可结合于硝酸纤维素上，早期用于分离RNA结合蛋白2、亲和层析高效分离DNA结合蛋白（1）寡核苷酸亲和纯化的基本要求 确定最小的核酸结合序列 隔开介质和识别序列的臂的长度 固相化介质应具有
28、适宜的液体流动性，从而允许蛋白 或蛋白复合物接近核酸序列,混合,DNA 蛋白 DNA 蛋白 G DNA G 蛋白,阻滞条带,足迹,凝胶阻滞分析 DNA酶足迹法,DNAaseI消化,修饰,mG mG,G G,mG G,剪切,剪切产物消失,修饰保护,修饰,G GG G,有限的随机修饰,GmGG G,G GmG G,G G G mG,mG G G G,从胶上切出，剪切,独特的剪切产物,修饰干涉,（2）非特异性结合的基本解决方案 利用一个非特异性寡聚核苷酸亲和预装柱，或用含有 随机的或杂乱无序的核酸序列亲和柱 在亲和柱内加入过量的非特异性寡核苷酸 在已知与非特异性蛋白高亲和结合部位侧翼序列情况 下，重新构建一个亲和柱，改变其高亲和部位的侧翼 序列3、纯化的蛋白测序、设计核苷酸探针或引物，筛cDNA 文库分离对应于DNA结合蛋白的克隆并表达三、鉴定必需的核酸蛋白1、RNA-蛋白复合物结构的测定2、RNA-蛋白复合物功能的测定,
