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1、第7章 生物催化剂酶Enzymes,羧肽酶,本章主要内容,酶的一般概念 酶的组成与维生素 酶的结构与功能的关系 酶的催化机理 酶反应的动力学 酶活性的调节,1.酶的概述,酶是生物催化剂。绝大部分酶是蛋白质，还有一些核糖核酸RNA具有催化作用，称为核酶（ribozyme）。,1.1 定义,细胞的代谢由成千上万的化学反应组成，几乎所有的反应都是由酶（enzyme）催化的。酶对于动物机体的生理活动有重要意义，不可或缺。酶在生产实践中有广泛应用。,1.2 酶的命名,（1）习惯命名依据所催化的底物（substrate）、反应的性质、酶的来源等命名。例如，胃蛋白（水解）酶、碱性磷酸酶。（2）系统命名 根据
2、底物与反应性质命名 反应：葡萄糖+ATP 葡萄糖-6-磷酸+ADP 命名：葡萄糖：ATP 磷酰基转移酶（习惯名称，葡萄糖激酶）,1.3 酶的分类,氧化还原酶 AH2+B A+BH2 转移酶 Ax+C A+Cx 水解酶 AB+H2O AH+BOH 裂解酶 A B+C 异构酶 A B 合成酶 A+B C，需要ATP,1961年酶学委员会（Enzyme Commission，EC）规定酶的表示法：EC.X.X.X.X例如：乳酸脱氢酶,1.4 酶活性(enzyme activity),酶活性的表示方法：酶活性指的是酶的催化能力，用反应速度来衡量，即单位时间里产物的增加或底物的减少。V=dP/dt=-d
3、S/dt 测定方法：吸光度测定、气体分析、电化学分析等。,酶活性的计量：EC 1961年规定：在指定的条件下，1分钟内，将1微摩尔的底物转变为产物所需要的酶量为1个酶活国际单位（IU）。比活性（specificity of enzyme）指的是每毫克酶蛋白所具有的酶活性单位数。比活性=活性单位数/酶蛋白重量（mg）比活性反映了酶的纯度与质量。,酶促反应的速度曲线,随着酶催化的反应进行，反应速度会变慢，这是由于产物的反馈作用、酶的热变性或副反应引起的。但是，在反应起始不久，在酶促反应的速度曲线上通常可以看见一段斜率不变的部分，这就是初速度。在酶的动力学研究中，一般使用初速度的（V0）概念。,高效
4、性 酶的催化作用可使反应速度比非催化反应提高108-1020倍。比其他催化反应高106-1013倍 例如：过氧化氢分解 2H2O2 2H2O+O2 Fe3+催化，效率为6104 mol/mol.s 过氧化氢酶催化，效率为6 106 mol/mol.s专一性 即对底物的选择性或特异性。一种酶只催化一种或一类底物转变成相应的产物。,1.5 酶的特点,绝对专一性 一种酶只催化一种底物转变为相应的产物。例如，脲酶只催化尿素水解成CO2 和NH3。相对专一性 一种酶作用于一类化合物或一类化学键。例如，不同的蛋白水解酶对于所水解的肽键两侧的基团有 不同的要求。立体专一性 指酶对其所催化底物的立体构型有特定
5、的要求。例如，乳酸脱氢酶专一地催化L-乳酸转变为丙酮酸，延胡索酸只作用于反式的延胡索酸（反丁烯二酸）。立体专一性保证了反应的定向进行。,R1:Lys,ArgR2:不是Pro,R3:Tyr,Trp,PheR4:不是 Pro,酶容易变性 这是酶的化学本质（蛋白质）所决定的。酶的可调节性 抑制和激活（activation and inhibition）反馈控制(feed back)酶原激活(activation of proenzyme)变构酶(allosteric enzyme)化学修饰(chemical modification)多酶复合体(multienzyme complex)酶在细胞中的区
6、室化(enzyme compartmentalization),已知的上千种酶绝大部分是蛋白质 单纯酶：少数，例如：溶菌酶（催化水解细菌多糖细胞壁）结合酶：大多数 结合酶=酶蛋白+辅因子 辅因子包括:辅酶、辅基和金属离子。,2.酶的组成与维生素,2.1 酶的化学本质,酶蛋白的作用：与特定的底物结合，决定反应的专一性。辅酶、辅基的作用：参与电子的传递、基团的转移等，决定了酶所催化反应的性质。有十几种.辅酶与辅基的异同点:它们都是耐热的有机小分子，结构上常与维生素和核苷酸有关。但是辅酶与酶蛋白结合不紧，容易经透析除去，而辅基通常与酶蛋白共价相连。金属离子的作用：它们是酶和底物联系的“桥梁”；稳定酶
7、蛋白的构象；酶的“活性中心”的部分。,结合酶举例，()内为辅因子：乳酸脱氢酶（辅酶I,NAD）异柠檬酸脱氢酶（辅酶I,NAD）醇脱氢酶（辅酶I,NAD）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（辅酶II,NADP）琥珀酸脱氢酶（FAD）乙酰辅酶A羧化酶（生物素，ATP，Mg+）脂酰辅酶A合成酶（辅酶A,CoA）,维生素（Vitamin）是动物和人类生理活动所必需的，从食物中获得的一类有机小分子。它们并不是机体的能量来源，也不是结构成分，大多数以辅酶、辅基的形式参与调节代谢活动。脂溶性维生素：A 视黄醇（维生素A原胡萝卜素）D 钙化醇 E 生育酚 K 凝血维生素水溶性维生素：B族维生素和维生素C（以下主要介绍B族
8、维生素与辅酶、辅基的关系）,2.2 维生素与辅酶、辅基的关系,B族维生素及其辅酶、辅基形式,VB1，硫胺素经焦磷酸化转变为TPP，焦磷酸硫胺素。它是酮酸脱氢酶的辅酶。,以VB2，核黄素为基础形成两种辅基FMN黄素单核苷酸和FAD黄素 腺嘌呤二核苷酸。作用是传递氢和电子。,尼克酸，烟酸（维生素Vpp）NAD+/NADH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化/还原）NADP+/NADPH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化/还原）。烟酰胺衍生物，传递氢和电子，氧化还原酶的辅酶。,泛酸（维生素B3）是CoA（辅酶A）的组成成分。CoA是脂酰基的载体。,吡哆醛和吡哆胺（吡哆素），维生素B6。磷酸吡哆醛是氨基酸转氨酶
9、、脱羧酶等的辅酶。,叶酸，其还原衍生物四氢叶酸是一碳基团转移酶的辅酶。一碳基团，如甲基、乙烯基、甲酰基等。,生物素，维生素H。噻吩和脲缩组成，CO2 的载体，羧化酶的辅酶，且有戊酸侧链。,硫辛酸，含硫脂肪酸，其巯基有氧化和还原两种形式，既可以传递氢和电子，又能转移脂酰基。,维生素B12中心钴原子结合5-脱氧腺苷基称辅酶B12，为一些变位酶和转甲基酶的辅酶。,单体酶 只有三级结构，一条多肽链的酶。如129个氨基酸的 溶菌酶，分子量14600。寡聚酶 含2-60 个亚基，有复杂的高级结构。常通过变构效应在代谢途径中发挥重要的调节作用。例如，乳酸脱氢酶。多酶复合体 由多个功能上相关的酶彼此嵌合而形成
10、的复合体。它可以促进某个阶段的代谢反应高效、定向和有序地进行。例如，由三个酶组成的丙酮酸脱氢酶系。,3.酶的分子结构,酶的活性中心（active site）与酶的催化活性有关的基团称为必需基团 活性中心内的必需基团 必需基团 活性中心外的必需基团 结合基团（与底物结合，决定专一性）活性中心 催化基团（影响化学键稳定性,决定催化能力）,酶的活性中心示意图,活性中心是酶分子上由催化基团和结合基团构成的一个微区,化学反应是由具有一定能量的活化分子相互碰撞发生的。分子从初态转变为激活态所需的能量称为活化能。无论何种催化剂，其作用都在于降低化学反应的活化能，加快化学反应的速度。一个可以自发进行的反应，其
11、反应终态和始态的自由能的变化（G）为负值。这个自由能的变化值与反应中是否存在催化剂无关。,4.酶的催化机理,4.1 活化能,催化剂降低了反应物分子活化时所需的能量,非催化反应和酶催化反应活化能的比较Ea，活化能；G，自由能变化,S+E ES P+E,中间产物,反应过程 S+E ES ES*EP P+E,过渡态复合物,4.2 中间产物学说,酶介入了反应过程。通过形成不稳定的过渡态中间复合物，使原本一步进行的反应分为两步进行，而两步反应都只需较少的能量活化,从而使整个反应的活化能降低。形成过渡态中间复合物是关键。,诱导契合学说认为，酶和底物都有自己特有的构象，在两者相互作用时，一些基团通过相互取向
12、，定位以形成中间复合物。,4.3 诱导契合学说（induced fit）,邻近与定向效应：增加了酶与底物的接触机会和有效碰撞。张力效应：诱导底物变形，扭曲，促进了化学键的断裂。酸碱催化：活性中心的一些基团，如His，Asp作为质子的受体或供体，参与传递质子。共价催化：酶与底物形成过渡性的共价中间体，限制底物的活动，使反应易于进行。疏水效应：活性中心的疏水区域对水分子的排除、排斥，有利于酶与底物的接触。,4.4 催化机理,影响酶促反应速度的因素与酶作为生物催化剂的特点密切有关。这些因素有：温度、酸碱性、底物（substrate）浓度、酶浓度、激活剂（activators）和抑制剂（inhibit
13、ors）等。,5.酶促反应的动力学及其影响因素,一般来说，随着温度升高，化学反应的速度加快。在较低温度条件下，酶促反应也遵循这个规律。但是，温度超过一定数值时，酶会因热变性，导致催化活性下降。最适温度（optimum T）：使酶促反应速度达到最大时的温度。最适温度因不同的酶而异，动物体内的酶的最适温度在37 0C-40 0C左右。有的温泉微生物的酶非常耐热，也有的酶在较低的温度下活性反而高。,5.1 温度对酶促反应速度的影响,酶反应的温度曲线和最适温度,5.2 溶液pH值对酶促反应速度的影响,最适pH（optimum pH）：使酶促反应速度达到最大时溶液的pH。,酶的最适pH与酶的性质、底物和
14、缓冲体系有关。在最适pH时，酶和底物之间有最好的结合状态。,在其他条件确定时，反应速度与酶的浓度成正比。,5.3 酶浓度对酶促反应速度的影响,酶浓度对反应速度的影响,5.4 底物浓度对酶促反应速度的影响,在其他条件确定的情况下，在低底物浓度时，反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应。当底物浓度较高时，v也随着S的增加而升高，但变得缓慢，表现为混合级反应。当底物浓度达到足够大时，反应速度也达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。反应速度对于底物浓度的变化呈双曲线，称为米氏双曲线，其数学表达式为米氏方程.,米氏双曲线,米氏方程的推导 首先假设：1.反应在最适
15、条件下进行 2.pH、温度和酶的浓度固定，变化的是底物浓度 3.反应在起始阶段，逆反应可忽略 4.反应体系处在稳态（stable state）,E+S ES E+P,k+1,k-1,k+2,根据中间产物学说，在稳态时，ES 中间复合物的生成速度与其分解速度相等，并有以下关系式：V1=V-1+V+2(1)k+1 E S=k-1 ES+k+2 ES=ES（k-1+k+2）E S=ES（k-1+k+2）/k+1(2)令（k-1+k+2）/k+1=Km(米氏常数)E S=ES Km(3),Et是自由酶E的浓度与结合酶ES的浓度之和，即 Et=ES+E(4)总的反应速度V应该等于 V+2=k+2ES(5
16、)将(4),(5)代入(3),整理得到 米氏方程:V=Vm S/(Km+S)V速度 Vm 最大速度 S底物浓度 Km 米氏常数,米氏常数是反应最大速度一半时所对应的底物浓度当Sm时，vm，呈零级反应,米氏双曲线,由米氏方程可知，米氏常数是反应最大速度一半时所对应的底物浓度,即当v=1/2Vm时，Km=S米氏常数Km=(k-1+k+2)/k+1在反应的起始阶段，k+2 k-1，m k-1k+1 平解离此时，m越大，说明和之间的亲和力越小，复合物越不稳定。当m越小时，说明和的亲和力越大，复合物越稳定，也越有利于反应。米氏常数m对于酶是特征性的。每一种酶对于它的一种底物只有一个米氏常数。,米氏常数及
17、其意义,米氏常数的求法,双倒数作图法,双倒数方程和双倒数曲线,5.5 抑制剂对酶促反应速度的影响,酶的抑制剂（inhibitor）:凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质。,酶抑制作用分为可逆抑制作用和不可逆抑制作用两大类。,（一）可逆抑制作用（reversible inhibition）抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析、超滤等物理方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合抑制等。,1.竞争性抑制（competitive inhibitor）,竞争性抑制剂因具有与底物相似
18、的结构，与底物竞争酶的活性中心，与酶形成可逆的EI复合物，减少的酶与底物结合的机会，使酶的反应速度降低的作用。这种抑制作用可通过增加底物浓度来解除。,竞争性抑制的动力学特点是Vmax不变，而Km增大,在可逆的竞争性抑制中，抑制剂通常是酶的天然底物结构上的类似物，两者竞争酶的活性中心。,在可逆的竞争性抑制中，抑制剂通常是酶的天然底物结构上的类似物，两者竞争酶的活性中心。磺胺类药物与细菌二氢叶酸合成酶的底物之一对氨基苯甲酸的结构相似，与其竞争酶的活性中心，从而达到抑菌的作用。,2、非竞争性抑制（non-competitive inhibitor）,非竞争性抑制剂与酶的活性中心以外的必需基团结合，形
19、成 EI 或ESI复合物，结果不能进一步形成产物P，于是使酶反应受到抑制，这种作用不能通过增加底物浓度的方法来消除。,在可逆的非竞争性抑制作用中：抑制剂结合在活性中心以外；抑制剂的结合阻断了反应的发生。,非竞争性抑制作用的动力学特点是Vmax变小，而Km不变。,(二)不可逆抑制（irreversible inhibition）抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，从而抑制酶活性。用透析、超滤等物理方法，不能除去抑制剂使酶活性恢复。,例如：有机磷农药中毒（敌百虫、敌敌畏、乐果杀虫剂1605、1059等）,乙酰胆碱酯酶是羟基酶，与有机磷农药共价结合后失活，使兴奋性神经递质乙酰胆碱不能及时清除
20、降解，而是过量地积累引起中毒。,金属离子如Mg+对磷酰基转移酶，Cu+对一些氧化酶，Cl-对淀粉酶有激活作用。一些有机小分子如Vit C，谷胱甘肽，巯基乙醇等对巯基酶有激活作用。,5.5 激活剂对酶促反应速度的影响,终产物 P 对途径开头和分支点上的关键酶活性的调节。字母e 表示酶。+表示激活，-表示抑制。,6.1 反馈控制(feed Back),6.酶活性的调节,变构酶模型,米氏双曲线与S形变构曲线,6.2 变构调节,0.11,变构酶有特征性的S形动力学曲线。变构剂或底物浓度，在一定的范围里，一个比较小的变化就会导致反应速度显著的改变，因此更具可调节性。变构酶通常是关键酶，催化代谢途径中的非
21、平衡反应，或称不可逆反应。这些酶一般处在途径的开始阶段或分支点上，通过反馈控制来调节。调节亚基与催化亚基分开，彼此独立的，称异促变构。变构剂与底物结合在同一个亚基上，称同促变构。,又称酶的共价修饰，有磷酸化/脱磷酸，腺苷酰化/脱腺苷酰以及甲基化/脱甲基等形式。酶的活性在两种状态之间变化。这个化学修饰过程也是由酶催化的。,6.3 化学修饰(chemical modification),磷酸化酶两种形式的相互转变过程,指催化相同的化学反应，但是理化性质不同的酶。如，氨基酸组成、电泳行为、免疫原性、米氏常数等不同。,乳酸脱氢酶同工酶 LDH，由2种亚基（M和H）组合成5种4聚体 H4和M4分别在心肌
22、中和 在肌肉中活性最高。,6.4 同工酶（isozyme）,大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶系模型,功能上相关的几个酶在空间上组织在一起，定向有序地催化一系列反应。例如，丙酮酸脱氢酶系由3个酶组成，脂肪酸合成酶系由6个酶和1个ACP蛋白组成。,6.5 多酶复合体(multienzyme complex),无活性的酶原（proenzyme），在特定的条件下，通过部分肽段的有限水解，转变成有活性的酶。如，动物的消化酶。,6.6 酶原激活,7.酶的应用,酶基因的缺失引起遗传病酶活性的高低作为疾病诊断指标酶作为试剂用于临床检验和科学研究酶和酶的抑制剂作为治疗药物酶制剂作为饲料添加剂酶用于食品加工酶用于工业生产,本章结束,
