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1、第三章 细胞工程基本技术,一、细胞工程实验室的设置 1 动物细胞工程实验室的设置 无菌操作室：更衣间、缓冲间、操作间 培养观察室 制备室 储藏室 清洗与灭菌室,2 植物细胞工程实验室的设置 除与动物细胞工程实验室相同的设置外，还有些特殊要求，如光照、试管苗培育和移植驯化等。,二、常用仪器与设备,超净工作台倒置显微镜和相差显微镜干燥箱水纯化装置冰箱（4、-20、-70）压力蒸汽消毒器,细胞记数板和电子细胞记数仪过滤除菌装置离心机移液管、吸管离心管移液器天平,动物细胞工程实验室基本设备仪器,1 培养箱,二氧化碳培养箱，提供恒定CO2（5%）以稳定pH值，温度：哺乳类35-37，鸟类38.5，气相：
2、O2、CO2,2 显微操作仪,3 细胞融合仪,4 细胞冷冻储存器（程序化冷冻仪和液氮罐-196）,5 培养用器皿 各种培养瓶、培养皿、多孔培养板（6、24、96）6 手术器械等,植物细胞工程实验室基本设备仪器,光照培养箱人工气候室摇床培养瓶,三、实验室的生物安全,根据密封程度的不同,将生物安全分为四个等级,即:P1、P2、P3、P4（protect）一般细胞培养按一级生物安全标准，其基本要求是：1、限制随便出入实验室；2、操作前后要消毒；3、不能用口吸取液体；4、禁止在室内进食、吸烟和存放食品；5、操作时着专门实验服；6、处理细胞前后要洗手；7、操作时在超净工作台。,四、培养用品的清洗,在培养
3、物中无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件，因此对培养器皿的清洗和灭菌是极为重要的环节。清洗的目的是清除杂质和微生物,使器皿内不残留任何影响细胞生长的成分(有害物质、微生物、细胞碎片及非营养性化学成分）。,1、玻璃用品的清洗 在细胞培养中，工作量最大的是玻璃器皿的清洗。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，而且不能残留任何物质。某些化学物质仅百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用。因此，玻璃器皿的清洗必须严格按照程序进行。一般玻璃器皿的清洗包括：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。,浸泡 初次使用和培养用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。培养后的玻璃器皿多附有大量蛋白质，用
4、完后应立即初步刷洗，浸泡在蒸馏水中，注意让水完全进入瓶皿中，不要留有气泡。使用新的器皿应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸(5)浸泡过夜或煮沸30分钟，中和其中的碱性物质后再清洗。刷洗 浸泡后的玻璃器皿要用软毛刷和优质洗涤剂（加热）刷洗。,浸酸 刷洗不掉的极微量杂质经过清洗液浸泡的强氧化作用可被除掉。清洗液对玻璃器皿无腐蚀作用，去污十分有效，是清洗过程中关键环节。清洗液是由重铬酸钾、浓硫酸和水按一定比例配制而成。浸泡时器皿要充满洗液，不留气泡。浸泡时间不应少于6小时，一般应浸泡过夜。,清洗液可根据需要，配制成不同强度：常用的有下面三种：强液：重铬酸钾63g，浓硫酸1000ml，蒸馏水200ml次
5、强液：重铬酸钾120g，浓硫酸200ml，蒸馏水1000ml弱液：重铬酸钾l00g，浓硫酸l00ml，蒸馏水1000ml 配制时先将重铬酸钾完全溶解于水，然后缓慢加入浓硫酸。新配制的清洁液为棕红色，经多次使用，水份增多或遇有机溶剂时成为绿色，这时表示清洁液已失效，应废弃而重新配置。也可以使用1040的硝酸溶液。,冲洗 玻璃器皿浸酸后必须用流水充分冲洗，每个器皿用流水灌满、倒掉，必须重复十次以上，不留任何残迹。最后用蒸馏水漂洗23次，用双蒸水漂洗1次，烤干备用。玻璃滤器原则上与玻璃器皿清洗相同。无论是浸泡还是浸酸、冲洗，都需用抽滤的方法。,2、橡塞清洗 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自
6、来水冲洗。胶塞类橡胶用品，每次用后先用蒸馏水浸泡，然后用2NaOH煮沸10-20 min，用自来水冲洗干净，再用1稀盐酸浸泡30min，用自来水冲洗、蒸馏水漂洗2-3次，最后双蒸或三蒸水漂洗1次，晾干后备用。,3、塑料器皿的清洗 细胞培养使用的塑料器皿主要有培养板、培养皿及培养瓶等。这些产品主要是进口的一次性商品，己消毒灭菌，打开就可使用。如想反复使用，清洗方法如下：用后立即用流水清洗或浸泡在水中，用脱脂棉清拭掉残留附着物，用2NaOH浸泡过夜，流水冲净后再用5盐酸浸泡30min，自来水冲洗、蒸馏水漂洗23次，最后三蒸水漂洗2次，晾干备用。,五、消毒灭菌,防止细菌、真菌和病毒等微生物的污染。消
7、毒灭菌的方法有多种，随物品不同，采用不同的方法。总的来说有物理方法和化学方法两大类。物理法包括：湿热(高压蒸气)、干热、过滤和紫外线等方法杀灭或去除微生物。化学法是使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。,（一）物理灭菌法1、紫外线消毒 常用来消毒空气，操作表面和一些不能用其它方法消毒的物品(如塑料培养皿等)。一般距紫外灯2.5米范围内直接照射20分钟即可。、电离辐射消毒 适用于消毒量大和不适于做高压或滤过的用品。,、湿热灭菌 湿热灭菌即高压蒸气灭菌，是最常用和最有效的一种方法。布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿及某些培养用液都可用此法消毒灭菌。各种物品有效消毒灭菌压力和时间不同，一般培养用液、橡胶制
8、品要求10磅(114)，1020分钟或8磅(112)30分钟。布类、玻璃制品、金属器械等为15磅(12l)20分钟。,、干热灭菌 主要适用于玻璃器皿的消毒灭菌。用电热鼓风干燥箱加温到160，保持1小时或更长时间，可达到消毒目的。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热消毒法。灼烧也属于干热消毒灭菌方法,、滤过除菌 大多数培养用液，如人工合成培养液、血清、酶溶液等，在高温下会变性，失去功能，必须采用滤过法除菌。玻璃滤器适用于各种培养液的滤过除菌。玻璃滤器根据滤板的孔径分为G1一G6几种规格，一般采用G6型(孔径在1.5m以下)，可达到除菌目的。微孔滤膜滤器，应选用孔径为0.22m的滤膜过滤除菌。各种
9、滤器必须先经高压蒸气消毒、烤干后方可使用。,（二）化学消毒法、消毒剂 细胞培养室的工作面、家具、墙壁、地面和空气等可用消毒剂进行灭菌处理。如：75酒精常用于皮肤和瓶皿开口部位的消毒；0.1新洁尔灭是目前最常用的消毒剂，可以对器械、皮肤、操作面进行擦拭和浸泡消毒；乳酸可用于空气消毒：来苏儿可用于地面消毒；过氧乙酸消毒能力很强，在0.5%的浓度下，10min就可将芽孢菌杀死。甲醛是一种光谱灭菌剂，其水溶液和气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。,、抗生素抗生素主要适用于培养用液消毒灭菌，不同种类抗生素适于杀灭不同微生物，多数是为了预防。最常用的抗生素为青霉素、链霉素和庆大霉素等。常规培养
10、用液抗生素浓度为：青霉素100单位ml、链霉素100单位m1、庆大霉素50gm1或l00gm1。,六、污染检测与控制 污染：一切与培养无关的杂质（微生物、化学物、细胞等）进入培养系统，影响培养物的正常生理机能。在众多的污染源中，微生物是最突出最重要最常见的污染。(一)微生物污染的途径 空气、器材、操作、血清和组织样本等。,（二）污染对培养细胞的影响及检测,1、细菌的污染检测与控制 当受到细菌污染时，培养液很快颜色变黄，产生大量酸性物质。显微镜下观察可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞停止生长、中毒、崩解死亡。采用普通肉汤培养基也可以检测到污染。用青霉素、链霉素可
11、预防细菌的污染,2、真菌的污染检测与控制常见污染真菌有烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、白念珠菌、酵母菌等。在培养液表面会出现白色或浅黄色漂浮物。显微镜下可见细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝。可用抗真菌剂防止真菌污染。,3、支原体的污染检测与控制 支原体的污染是一个常见而棘手的问题，外观上看不出明显的变化，实际上或多或少的影响到细胞的众多机能。目前尚无有效的防范措施。可通过支原体培养、PCR及电镜观察等方法进行检测。支原体的去除可采用：41C,4、病毒的污染检测与控制 病毒的污染主要是通过DNA的整合，改变培养细胞的生物学性状，影响细胞的生长或干预实验结果的准确性。对病毒的检测主要有直接观
12、察、动物接种检查、电镜观察、免疫学及PCR法。,5、细胞交叉污染及检测 在培养的细胞中混杂有其它细胞，从而对培养的细胞产生形态或生长特性等方面的影响。常采用形态观察或检查细胞的标记物进行检测。有效防治采取的措施：1）严格操作，器具分明，空间隔离；2）细胞的取放严禁接触培养液瓶口；3）对培养的细胞要有充足的储备。,（三）污染的预防 1、培养操作前的准备(超净工作台的严格护理)2、培养操作时的注意事项 3、其他注意事项,七、无菌操作技术（无菌操作的基本要领和要求）,在细胞培养中防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染
13、。为达到这一要求，所有工作要进行得有条不紊和安全可靠。,（一）培养前的准备 要充分做好培养前的实验用品准备工作，根据研究内容的要求进行物品清点包装，注明标签后灭菌、烤干备用。在工作前移入超净工作台内。（二）培养室和超净工作台的消毒 工作面先用新洁尔灭擦拭一遍后，打开紫外线灯灭菌，用30W紫外线灯管直接照射2030分钟。然后关闭紫外灯，打开风机。超净工作台要用75酒精擦拭。培养用液和培养细胞不能放在紫外线下直接照射，在操作时随手携入。,（三）洗手和着装 原则上与外科手术洗手相同：先用肥皂刷洗手和前臂，再用流水冲洗，然后用0.2新洁尔灭或75洒精棉球擦洗。穿无菌服，戴无菌帽和口罩。（四）无菌培养操
14、作 在无菌条件下操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作，如安装吸管橡皮头、打开瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行（火焰消毒）。,注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长，以防退火。烧过的用具要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。进行细胞培养操作时，动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及器皿的无菌部分，如已接触，要更换或用火焰烧灼触及部。,为拿取方便，工作台面上的布局要合理，原则上为右手使用方便的用品放在右侧，左手用品在左侧。培养液等不要过早开瓶，不要长时间直立暴露开口，以免增加污染机会。吸取不同用液时，均应分别使用不同的吸管，以防扩大污染或增加混
15、淆不同细胞的机会。,八、显微技术,各种显微镜技术同细胞生物学要掌握原理与应用,九、细胞观察与分析,细胞在培养过程中，要及时观察和了解生长增殖状况，包括新生、增殖、消亡等各种状态的时间参数、细胞数量、分布位置等指标，以及体外因素对这些指标的调节机制。这属于细胞动力学的研究。广义的细胞动力学还包括其它的细胞运动及其原理的研究。,（一）细胞技术与活力分析,1、细胞计数法 用血球计数板计数细胞悬液中的细胞数目，然后根据需要进行必要的调整。2、细胞生长曲线 生长曲线是反映培养细胞的时间与培养细胞浓度之间关系的曲线。以时间（横坐标）对细胞浓度（细胞数/ml为纵坐标）绘制，反映培养过程中细胞生长与死亡的动态
16、变化。,3、有丝分裂指数的测定 在一群细胞中，进入分裂期细胞所占该群细胞的百分率，即为有丝分裂指数。它反映了细胞增殖的速度。分裂细胞数 分裂指数=100%细胞总数4、细胞贴壁率 又称接种存活率，贴壁附着生长的细胞状况直接反映细胞的生存能力。,5、流式细胞仪检测细胞周期 细胞周期各时相控制并按一定的时间顺序予以表达的，而细胞周期各时相的分析，特别是细胞周期及其各时相时长的测定对于研究细胞群体的生长行为，尤其是对于包括DNA复制、细胞分裂在内的细胞增殖调节控制的研究，无疑是一个很重要的前提。,基本步骤细胞培养消化细胞计数种植60 mm 培养皿（70 X104 个细胞/皿）药物处理细胞收细胞（胰蛋白
17、酶消化-培养基终止）2000转/分 离心 10min去上清液PBS重悬，重复6的步骤去上清加入100 ul 1mg/mlPI 和100ul 1mg/ml RNase A,避光处理30min流式细胞仪检测,6、MTT比色法测定细胞活力 活细胞表现出线粒体脱氢酶活性，可将染料MTT还原为难溶的紫色结晶物沉积在细胞内，经酸性异丙醇溶解后呈现的色度可反映出生活细胞的代谢水平。而死细胞则无此酶活性。,MTT检测细胞存活率基本步骤细胞培养消化细胞计数种植96孔板（110X 103 个细胞/孔）药物处理细胞，结束4小时前每孔加入20 ul 5 mg/ml MTT弃上清，每孔加100 ul DMSO560 n
18、m 检测Viability(%)=OD560,TV/OD560,control 100,7、成集落实验（Colong-forming test）在集落刺激因子存在下培养细胞，可刺激培养细胞分化产生大小不同的细胞集落，这样的集落形成细胞称体外培养集落形成细胞，它是检验培养细胞能否增殖的过硬指标之一。平均集落数 集落形成率=100%接种的单个细胞数,（二）细胞固定与染色观察,1、细胞固定2、细胞染色 H.E（苏木精-伊红）：样品制备、染细胞核、染细胞质、脱水、透明和封片。Giemsa染色法：细胞核或染色体染成紫红色或蓝紫色，细胞质染成粉红色。Feulgen染色法：考马斯亮蓝染色法：细胞骨架。,免疫
19、荧光染色 免疫过氧化物酶染色法,3、细胞培养中常用的染色方法,活体染色：在体外条件下用某种染色剂对活的组织或细胞进行染色,而对活细胞的生理活动不产生任何明显的影响。用于活体染色的染料称为活体染料或活体染色剂，分为碱性和酸性两类：碱性活体染料：次甲基蓝、中性红、詹纳斯绿、甲基紫等，常用于体外活体染色。酸性活体染料：台盼蓝、刚果红等，只用于体内活体染色，体外活细胞难以着色。,活体染色方法1）台盼蓝染色 活细胞不着色，死细胞染上兰色。2）吖啶橙荧光染色法 直接染色观察活细胞或固定染色观察细胞。吖啶橙是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料，在蓝光或紫外光激发下，原来的活细胞，其核呈亮绿色，核仁、RN
20、A呈桔红色，胞质呈淡红褐色。而原来是已经死亡的细胞，核呈暗绿色，胞质呈亮铜色。,染色排除检测法 以死细胞和活细胞对色素的不同吸附来鉴别。死细胞的细胞膜透性发生变化，染料大量进入而不能排出，因此而着色。而活细胞能及时排出进入细胞的染料或染料不能进入活细胞，故不着色。这类染料大多为酸性染料，主要有：台盼蓝、苯胺黑、赤藓红B、伊红Y等。1、台盼蓝排除检测法 2、溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法 EB和PI均为荧光染料，可特异与DNA结合。发橙红色荧光的为死细胞。,（四）凋亡细胞的观察,细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的细胞死亡方式，是在一定的生理或病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控，激活内源性
21、核酸内切酶而发生的细胞自动消亡的过程，亦称为程序化细胞死 亡(programmed cell death，PCD),形态学检测光学显微镜观察 样品涂片或组织切片经常规处理、HE染色后，即可放在油镜下观察。该方法简便，缺点是只有在发现了具有特征性的凋亡小体时才能确定为阳性，因而不易检出早期的凋亡细胞，而且某些类型的细胞坏死(如凝固性坏死)与细胞凋亡形态相似，两者不易区分。因此，该方法只能作为细胞凋亡初步推测的基础，不能作为诊断的手段。,荧光显微镜观察,根据细胞膜完整的活细胞对阳离子染料有拒染能力，而坏死细胞可被上述染料标记的原理，用荧光染料吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)、溴化乙锭(EB)等染色
22、，在荧光显微镜下可观察到凋亡细胞的细胞核改变和凋亡小体的形成。这种方法适用于对体外培养细胞悬液的检测组织脱蜡切片经RNA酶作用后也可用此法染色观察。荧光显微镜检查法方便易行，现已成为细胞凋亡检查的常用手段。,透射电子显微镜观察,凋亡细胞在电子显微镜下可见细胞体积变小，细胞质浓缩，内质网、线粒体增多，细胞膜微绒毛消失、起泡、出芽、形成凋亡小体。超微结构观察是诊断细胞凋亡最可靠的方法。但该法只能定性，不能定量，而且观察到凋亡小体的几率也不高，在体内试验时，凋亡小体可能很快被巨噬细胞吞噬清除，而不易观察到；此外，用电子显微镜检测细胞凋亡，样品制备步骤繁琐、耗时、昂贵。,共聚焦激光扫描显微镜检测,共聚
23、焦激光扫描显微镜是20世纪80年代发展起来的一种新型仪器，是在荧光显微镜的基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使紫外光和可见光激发荧光探针，从而得到清晰的细胞内部结构。该方法能用于细胞的形态学分析，而且还能对凋亡细胞内的大分子进行定位。,上述形态学检测方法最大的局限性是只能定性，不能有效定量，而且判定时难免存在主观性，故常作为其他检测方法的基础。,凋亡细胞膜结构的分析与检测,染料排斥法 除了电子显微镜能反映细胞膜的完整性外，还可用染料排斥法，如台盼蓝、PI等。坏死细胞的膜发生破损，易被染料着染，而凋亡细胞的膜完整，不被着染，从而可以判断细胞凋亡与坏死。但在体外培养的细胞最终也会发
24、生继发性坏死，因此，此法不能单独用来判断Ap细胞是否发生凋亡。,流式细胞仪观察法,流式细胞仪观察是判断细胞质膜的不对称性。在正常细胞膜上，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)位于细胞膜的内侧；而在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面。因此，PS基团位置的改变，可作为凋亡细胞的一种标志。膜联蛋白中的AnnexinV，即锚定蛋白，是一种Ca依赖性磷脂结合蛋白，与PS具有高亲和力。将AnnexinV进行荧光素(FITC、PE)标记，以标记的AnnexinV处理细胞悬液，利用流式细胞仪(或荧光显微镜)即可检测细胞凋亡的发生。若将AnnexinV和荧光素PI匹配使
25、用，可以将凋亡细胞和坏死细胞区分开来：AnnexinV为阳性，PI为阴性的细胞即为凋亡细胞；双染色细胞或是坏死细胞，或是凋亡晚期细胞(归因于次级坏死)。,DNA片段化检测,DNA 电泳图谱法 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩，染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂，形成180 200 bp长的DNA片段或整数倍的寡核苷酸片段。凋亡细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的梯形电泳图谱，而坏死细胞电泳后呈模糊的涂片状。,ELlSA 法分析组蛋白,细胞发生凋亡时，Ca、Mg 依赖性内源性核酸内切酶被激活，在核小体连接区切开
26、双链DNA，产生带有单个或寡聚核小体的DNA片段。而核小体DNA 与中心组蛋白H z A、H。B、Hs和H 紧密结合，又可以防止核酸内切酶的切割作用，故产生的DNA 片段是180200bp的整数倍，在凋亡细胞的胞浆中出现核小体或寡聚核小体。该法是利用“夹心定量酶标免疫测定法”的原理，用抗组蛋白一生物素和抗DNA一过氧化物酶(POD)分别结合到核小体的组蛋白和DNA,成分上，洗涤除去未结合的抗体后，加入POD底物产生颜色反应，通过酶标测定仪分析，即可定量反映细胞凋亡的水平。该方法的优点是：灵敏度高，操作快捷，无放射性同位素污染，可定量测定细胞凋亡，无需预先标记细胞，所用抗体不具有种属特异性，PO
27、D标记的抗DNA抗体可与单链和双链的DNA起反应。抗体夹心酶联免疫分析法可以测定核小体单体和寡聚核小体，因而可以用于许多不同的培养细胞株或动物组织细胞的凋亡检测。,DNA 末端标记法,1993年Wijsman等提出了DNA 片段末端标记法，1994年Fehsel等。提出了原位缺口转移检测细胞凋亡的方法。这些方法的建立特别是由DNA片段末端标记技术发展而成的TUNEL法termina deoxy nucleotibyl transferase(TdT)一mediated dUTPbiotin nick end labelling，TUNEL labeling 的试剂盒化，使细胞凋亡的原位检测在诸
28、多领域的研究中得到广泛应用。,举例,形态学检测基本步骤细胞培养消化细胞计数种植24孔板（15X 104 个细胞/孔）药物处理细胞用数码照相架拍摄形态照片吸走培养基，PBS洗涤一次，95%乙醇固定20min吸走乙醇每孔加200ul 丫啶橙避光10min 激光共聚显微镜观测,PS（磷脂酰丝氨酸）外翻检测,基本步骤细胞培养消化细胞计数种植60 mm 培养皿（70 X104 个细胞/皿）药物处理细胞收细胞（胰蛋白酶消化-培养基终止）调整细胞密度为1X106/ml取500ul 加入1.25 ul Annexin V-FITC 室温避光处理15min400g 离心 10min去上清，500ul PBS重悬,加1.25 ul 10mg/mlPI流式细胞仪或激光共聚焦检测检测,十、细胞培养物的保存和复苏（缓冻速溶）,保存：低温冷冻保存法 冷冻保护液：含10%血清的培养液中加10%的甘油或7.5%10%的二甲基亚砜（DMSD）首先将细胞放入冷冻保护液进行预冷却，然后按1 ml/安瓶装瓶封口。再放入慢冻机按每分钟下降1 的速度缓慢冷冻至25，最后放入液氮。-90可保存6个月，-196几乎可无限期保存。,复苏 迅速取出盛冰冻细胞的安瓶投入37水浴中，继而摇动安瓶使内容物在20-60秒内完全恢复悬液状态。,
