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1、2023/7/31,1,1.色谱技术概述,1.1概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同，经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的。1.2特点：（1）纯化倍数高（2）操作规模小，放大困难（3）终产品纯化（4）适用于价格昂贵的产品,2023/7/31,2,1.3色谱的分类,1.根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类,凝胶色谱,亲和色谱,离子交换色谱分离法,吸附色谱法,分配色谱法,2023/7/31,3,根据固定相的形状不同的分类：,柱色谱法,薄层色谱法,2023/7/31,4,3 根据流动相的物态不同的分类：,
2、液相色谱（LC）：LLC、LSC,反相色谱：固定相极性小于流动相,4 根据流动相与固定相的极性分类：,正相色谱：固定相极性大于流动相,气相色谱（GC）：GLC、GSC,2023/7/31,5,2.色谱分离的基本原理,任何色谱分离过程实质上都是溶质随流动相流动而迁移的过程，不同溶质在流动相和固定相中的分配比例不同，因而随流动相迁移的速度不同，从而使不同物质分离开来。,2023/7/31,6,2.1色谱分离的基本原理,（1）分配系数：溶质在固定相与流动相浓度比值可由Langmuir方程得出Kd-分配系数q、c-溶质在固相和液相中的浓度,2023/7/31,7,（2）阻滞因子Rf 定义：阻滞因子是在
3、色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 意义：在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小,2023/7/31,8,2.2色谱图及基本概念,（1）色谱图：混合液中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱柱进入监测器，监测器的响应信号时间（或流动相体积）曲线，称为色谱图或色谱流出曲线。（2）基线：在操作条件下，色谱柱出口没有组分流出，仅有流动相流过监测器，此时流出的曲线。（3）色谱峰：当样品中的组分随流动相流入监测器时，监测器的响应信号随时间变化所形成的峰形图形。（4）峰形：对称于峰尖的正态分布曲线。拖尾峰、前伸峰,2023/7/31,9,洗脱曲线,
4、返回,2023/7/31,10,（5）洗脱体积色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异,2023/7/31,11,（6）保留值,保留值：混合物中各组分在色谱柱中停留的时间或将组分带出色谱柱所需流动相体积的数值保留时间（tR）：从开始进样至柱出口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。死时间（t0）：不被固定相滞留的组分（空气等），从开始进样至出口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。校正保留时间（tR）：扣除死时间后的保留时间。（tR tR-t0）保留体积（VR）、死体积（V0）、校正保留体积（VR）相对保留值（r2，1）：在
5、相同操作条件下，待测组分与参比组分的校正保留值之比。,2023/7/31,12,(7)分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组色谱峰峰底宽度平均值之比。,峰宽（W）：两侧拐点处所作的切线与峰底相交于两点，此两点的距离。（见图）半高峰宽（W1/2)：1/2峰高处的峰宽。峰高：峰顶点与峰底的垂直距离。峰面积：峰与峰底之间的面积。标准偏差（）：0.607h峰高处的峰宽的1/2区域宽度（峰宽、半高峰宽、标准偏差）W=4,R1完全分离,2023/7/31,13,（8）色谱柱的理论塔板：流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的一段柱高（塔板高度）反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数
6、的计算方法：N-理论塔板数 tR-保留时间W1/2-半峰宽 Wb-峰底宽度理论塔板高度：H L-柱长,2023/7/31,14,3.色谱系统的基本组成,2023/7/31,15,Pharmacia KTA 层析系统,2023/7/31,16,调糊预装一定量的溶剂或缓冲液连续加入悬胶液打开出口阀：层析剂沉降排除空气检查均匀度,4.色谱分离操作,（1）装柱与平衡,2023/7/31,17,（2）上样（吸附）,样品处理：(1）溶解A.调整浓度B.盐C.pH(2)过滤：除去不溶物流速：根据样品浓度与吸附速度而定上样量：80%吸附容量,2023/7/31,18,（3）淋洗,盐浓度pH 表面活性剂（0.1
7、-0.5%)淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定防止产物丢失又要除去杂质,2023/7/31,19,（4）洗脱方法,按操作方式a 恒定洗脱(isocratic elution)b 分步洗脱(stage elution)c 梯度洗脱(gradient elution)按洗脱机理专一性洗脱（specific elution）非专一性洗脱（nonspecific elution）添加剂：乙二醇,NaCNS、脲素、盐酸胍 洗脱体积：5倍床体积,2023/7/31,20,（5）清洗与再生,弱酸：HAc碱：氨水促溶剂：1-3M KCNS，6-8 M 尿素，6 M盐酸胍极性溶剂：20%乙醇表面活性剂：吐温-8
8、0缓冲液平衡,2023/7/31,21,离子交换色谱凝胶过滤吸附色谱亲和色谱分配色谱疏水作用层析,5 各种色谱技术介绍,2023/7/31,22,（1）离子交换色谱,原理：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的缓冲液为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法。,2023/7/31,23,常用的离子交换剂,葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25纤维素系列离子交换剂琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B Bio-Gel A 系列交联
9、琼脂糖离子交换剂大孔性离子交换剂,2023/7/31,24,离子交换柱层析操作,树脂的选择树脂的预处理及转型装柱及平衡（要保持均匀、无气泡和断层）首先加入1/3h的起始缓冲液或水；其次加入树脂使树脂借助水的浮力缓慢自然沉降；最后用水或缓冲液平衡到所需要的条件，如特定pH、离子强度等。上样：将溶解在少量溶剂中的试样加到柱上部 洗涤与洗脱：改变pH或离子强度 收集与检测,2023/7/31,25,怛定洗脱,2023/7/31,26,分步洗脱,2023/7/31,27,(c)梯度洗脱,2023/7/31,28,（2）凝胶过滤,原理：凝胶过滤所用的基质具有立体网状结构，筛孔直径一致，且呈珠装颗粒物质，
10、这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而不能排阻某些小分子化合物，但可让其在筛孔中自由扩散和渗透。因此，混合物分子大小不同，通过介质所需阻力不同，从而被分离。流出顺序：大分子中等分子小分子,2023/7/31,29,2023/7/31,30,在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离优点：操作简便分离效果好，重复性高，回收率高分离条件温和，不会使物质变性凝胶不用再生，可反复使用缺点：分离速度较慢、选择性低（仅分子量大小）、料液处理量少,2023/7/31,31,分配系数a.公式b.大小排阻程度（0100%)Vt(床体积）r2h 外水体积
11、（V0）+内水体积（Vi）+颗粒实际占有体积(Vg)(i)完全排阻组分 Kav0 VeV0（ii）部分排阻组分 Kav（0-1）（iii）完全进入胶孔组分 Kav1 VeVt,2023/7/31,32,凝胶过滤介质,葡聚糖凝胶（sephadex）由葡聚糖+环氧氯丙烷交联而成 sephadex G 10 15 25 50 75 100 200琼脂糖凝胶（Sepharose）天然凝胶 Sepharose 2B 4B聚丙烯酰胺凝胶（BioGel）BioGel p2 p4 p100等（编号100为排阻现）疏水性凝胶应用：分离、浓缩；脱盐；测定分子量,2023/7/31,33,（3）吸附色谱,原理:利用
12、溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离。（吸附解吸再吸附连续过程）分类：柱色谱和薄层色谱分配系数（K）与迁移率（Rf）关系 K大，Rf小 K小，Rf大,2023/7/31,34,柱色谱的操作吸附剂的选择,（1）依据a.比表面积大b.颗粒均匀c.稳定性强d.成本低e.分辨率高（对不同的物质有不同的解吸能力）如：极性吸附剂易吸附极性化合物；但便于解吸，极性化合物，应选择极性较小的吸附剂,2023/7/31,35,（2）吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2色谱柱的选择a.平直、均匀
13、；D：L1：1040；砂芯或玻璃棉b.分辨率低，选长柱；D大，L大,2023/7/31,36,柱色谱的操作洗脱剂的选择（1）原则 纯度高、稳定性好、对样品溶解度大，易与其它组分分开（2）常用硅胶、氧化铝：洗脱剂 极性小极性大活性炭或非极性大孔树脂：洗脱剂极性大极性小羟基磷灰石（吸附蛋白质）：盐缓冲液洗脱,2023/7/31,37,薄层吸附色谱,展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果展开剂选择的原则：（1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小（2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力,2023/7/31
14、,38,薄层吸附色谱（操作）,制板：硅胶G板，硅胶CMC板点样：少量多次、D3mm、边 1.52cm展开：密闭容器、提前配好展开剂；溶剂不能浸没样品点；展完后划前沿及样品移动距离检测：紫外线照射；喷雾显色；碘蒸汽等,2023/7/31,39,（4）分配色谱,原理：固定相为因吸附等作用而滞留于固体载体表面的一薄层液体，利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法要素：固定相、载体、流动相,2023/7/31,40,载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体载体种类：硅胶:含水量大于17或以水为展开剂时，硅胶失去了直接吸附溶质的能力，在硅胶表面附着的水作为固定相，因而为分配色谱硅藻土纤维素葡聚糖凝胶,2023/7/31,41,（5）亲和色谱,利用高分子化合物可以和与它们相对应的配基，进行特异并可逆结合的特点来进行分离的，把相应的一对配基中的一个通过物理吸附或化学共价键作用，固定在载体上使它变成固相，装在层析柱中来提纯其相对应的配基。,2023/7/31,42,（6）正相/反相层析,(6.1)根据极性a.正相色谱:流动相极性固定相极性b.反相色谱:流动相极性固定相极性(6.2)洗脱顺序a.正相色谱:极性小极性大的化合物b.反相色谱：极性大极性小的化合物,
