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1、实验2 蛋白质的等电点测定和沉淀反应,实验目的,了解蛋白质的两性解离性质,学习测定蛋白质等电点的一种方法,加深对蛋白质溶液稳定因素的认识,了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义,蛋白结构改变可导致其溶解度发生改变,在pHpI时，蛋白带负电，蛋白分子相互排斥,蛋白呈溶解状,在pHpI时，蛋白带正电，蛋白分子相互排斥,蛋白呈溶解状态,实验原理,在pH=pI时，蛋白不带电，蛋白溶解度最低(注:不一定沉淀),蛋白的可逆沉淀:结构可以恢复(非变性),蛋白带电性质的改变所引起的溶解度发生改变,蛋白的不可逆沉淀:结构不可以恢复(变性),蛋白经高温加热,盐析和特定条件下的乙醇作用(低温和短时间),蛋白和重金属作
2、用:如硝酸银,蛋白和某些有机酸作用:如三氯乙酸,试剂和器材,试剂,&新鲜鸡蛋,&0.4%酪蛋白醋酸钠溶液 取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用少量40-50的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10mL 1mol/L醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移到100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。,&1.00mol/L、0.10 mol/L、0.01 mol/L醋酸溶液,&蛋白质溶液 5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1:9）,&pH4.7醋酸醋酸
3、钠的缓冲溶液 100mL3%硝酸银溶液 10mL5%三氯乙酸溶液 50mL95%乙醇 250mL饱和硫酸铵溶液 250mL硫酸铵结晶粉末0.1mol/L盐酸溶液 300mL0.1mol/L氢氧化钠溶液 300mL0.05mol/L碳酸钠溶液 300mL甲基红溶液 20mL,器材,水浴锅 温度计 200mL锥形瓶 100mL容量瓶 吸管 试管及试管架 乳钵,实验操作,酪蛋白等电点的测定&取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。,试管号 蒸馏水 0.01 mol/L醋酸 0.1 mol/L醋酸 1.0 mol/L醋酸 pH 混浊程度(mL)(mL)(mL)(mL)1 8.4
4、 0.6 5.9 2 8.7 0.3 5.5 3 8.0 1.0 4.7 4 7.4 1.6 3.5,&4支试管中各加4%酪蛋白醋酸钠溶液1mL并马上摇匀。观察其混浊程度。静置10min后，再观察其混浊度。最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。,蛋白质的沉淀及变性,蛋白质的可逆沉淀 盐析:无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）能析出蛋白质。,加蛋白质溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数min,观察是否有沉淀,为什么？(沉淀为球蛋白)。,倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？,将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止。观察是否有沉淀,为什么？(沉淀为清蛋白
5、)。,蛋白质的不可逆沉淀,&重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。,取1支试管，加入4%酪蛋白醋酸溶液2mL，再加3%硝酸银溶液1-2滴，振荡试管，观察是否有沉淀,为什么？,如有沉淀产生。倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？,&某些有机酸沉淀蛋白质,取1支试管，加入4%酪蛋白醋酸溶液2mL，和 1ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察是否有沉淀,为什么？,如有沉淀产生。倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？,&有机溶剂沉淀蛋白质,取1支试管，加入4%酪蛋白醋酸溶液2mL，再加入2mL95%乙醇。观察沉淀的生成（如果沉淀不明显，加点
6、NaCl，混匀)。,如有沉淀产生。倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？,&乙醇沉淀蛋白质,取3支试管，取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂,摇匀并观察是否有沉淀生成：,试管号 蛋白溶液 0.1 mol/L NaOH 0.1 mol/L HCl 95%乙醇 pH4.7(mL)(mL)(mL)(mL)缓冲液(mL)1 1 1 1 2 1 1 1 3 1 1 1,以上3支试管再分别加入以下试剂,观察颜色和沉淀现象 试管号 水 甲基红 0.1 mol/L 醋酸 0.05 mol/L 碳酸钠 0.1 mol/LHCl(mL)(滴)1 8 2 8 1滴(观察颜色)用 醋酸中和pH 数滴 3 8 1滴(观察颜色)用碳酸钠中和pH 数滴,
