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1、复 习,1、含有杂环的亚氨基酸是_。脯氨酸2、组成蛋白质的氨基酸除_外均含有不对称碳原子，所以具有_。甘氨酸，旋光性3、异亮氨酸属于哪一类氨基酸（）A 支链 B 芳香族 C 杂环 D 碱性A4、下列属于必需氨基酸的是（）A 天冬酰胺 B谷氨酰胺 C酪氨酸 D赖氨酸D,第三章 蛋白质化学（下）,第六节 蛋白质的结构（重点）,蛋白质结构的研究内容,由哪些氨基酸组成？各种氨基酸的含量？氨基酸之间如何连接？不同氨基酸的排列顺序如何？氨基酸长链的空间形状如何？,蛋白质的结构层次,一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构四级结构,一、一级结构（序列）,多肽链中氨基酸残基的排列顺序，也称为蛋白质的序列或蛋白
2、质的化学结构。左N右C,什么是序列分析？,根据完全水解所获得的氨基酸组成知识，按照预先设计好的策略，对多肽进行部分水解、末端测定、短序列分离和完全水解等，从而得出蛋白质多肽链的完整的氨基酸序列。,蛋白质序列分析的意义,研究蛋白质结构和功能的关系人类血红蛋白变种有300多种,有些变种严重影响分子的携氧的能力，进行序列分析有助于说明血红蛋白的结构与功能差异寻找基因根据蛋白质序列可以反推DNA序列，有助于确定基因和克隆基因,蛋白质序列分析原则,1、确定多肽链的数目，肽链拆分-获得单一多肽链,多肽链的拆分,非共价交联酸、碱、高浓度的盐、变性剂处理8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍,通过链间二硫键交联
3、或者存在链内二硫键氧化或者还原二硫键使其断开,1）巯基乙醇法,用过量巯基乙醇还原二硫键使其断开加入碘乙酸保护生成的巯基,2）过甲酸法,加入发烟甲酸将二硫键氧化成磺酸基从而断开二硫键,3）二硫苏糖醇法,加入二硫苏糖醇或者二硫赤蘚糖醇还原二硫键,2、蛋白质多肽链的组成分析-确定每条肽链的氨基酸的种类和数量（需要蛋白质完全水解）,蛋白质序列分析原则,3、蛋白质多肽链的末端分析-确定末端氨基酸N末端测定C末端测定,蛋白质序列分析原则,1）N-末端测定,DNFB法PITC法DNS法氨肽酶法,DNS法,丹磺酰氯（二甲基氨基萘磺酰氯）6mol/L HCl 105水解18hr,氨肽酶法,外切酶，从多肽链的N-
4、端逐个的向里水解根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序,2）C-末端测定,肼解法多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离,羧肽酶法,羧肽酶A作用于促肾上腺皮质激素氨基酸的释放曲线,4、对多肽链进行部分水解(酶解)，获得一套短肽混合物；用不同的酶分别进行,得到几套短肽混合物,蛋白质序列分析原则,肽链部分水解的方法,化学法溴化氰法羟胺法酸酶解法（切点多，肽段大小不一）胰蛋白酶,1）溴化氰法,断开甲硫氨酸羧基参
5、与的肽键由于蛋白质中含有很少的甲硫氨酸，因此可以得到较大的片断,2）羟胺法,羟胺能专一地裂解Asn-Gly的肽键,5、分离短肽混合物-获得单一的短肽 6、测定所有短肽的的氨基酸序列,7、将所获得的所有序列进行拼凑,确定蛋白质序列8.测定二硫键位置，测出全部一级结构,蛋白质序列分析原则,二、二级结构,蛋白质多肽链自身的折叠和盘绕方式肽链骨架原子的相对空间位置，不涉及侧链维持二级结构的力：氢键,肽平面,肽平面各个原子所构成的键长、键角在蛋白质构象中恒定不变,二级结构的种类,-螺旋折叠转角自由回转,1、-螺旋,绝大多数为右手螺旋-角蛋白：全部由-螺旋构成结构要点每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈每圈向
6、上移动0.54nm氨基酸残基侧链伸向外侧，相邻螺圈间形成氢键，氢键基本与中心轴平行SN：3.613,-螺旋,完成一个螺旋需3.6个氨基酸残基，螺旋每上升一圈，螺距为0.54nm，相邻两个氨基酸残基之间的轴心距为0.15nm,l维持螺旋的作用力是氢键，相邻螺圈之间 形成链内H键，H键的取向几乎与轴平行。H键位置：由每个残基的CO基与其相 邻的第四个残基的 NH的形成H键，所有肽键的NH和CO都参与氢键的形成，故-螺旋很稳定。,-螺旋,2、折叠 由两条或两条以上几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间氢键交联而成。肽链的主链成锯齿状折叠构象。,要点：l肽链几乎是完全伸展的，整个肽链成折叠形式。l两条或
7、多条链相互平行，按层排列，相邻的肽链之间形成肽 间的氢键，氢键由主链的-C=O与-NH之间形成氢键，所有的肽键都参与氢键的形成，氢键取向与肽链的长轴接近垂直。l-折叠两种类型：平行式：所有肽链的N端都在同一端。反平行式：相邻的两条肽链方向相反。,折叠,折叠（平行）,氢键倾斜,折叠（反平行）,氢键垂直，更稳定,球状蛋白质中广泛存在的一种结构肽链发生180度回折，回折角度就是-转角结构。维持力：由一个AA残基的C=O与第四个AA的残基的NH之间形成氢键。甘氨酸和脯氨酸易于形成-转角。,3、-转角,4、无规卷曲,无规卷曲是指多肽链主链部分形成的无规律的卷曲构象。,-螺旋,-折叠,-转角,无规卷曲,三
8、、超二级结构,二级结构和三级结构的过渡态若干相邻的二级结构彼此相互作用，形成有规则的二级结构组合体；不具有功能；组合方式：、,超二级结构（转角）,超二级结构（）,超二级结构（曲折）,四、结构域,多肽链在超二级结构基础上进一步缠绕折叠形成紧密的近似球状的结构多结构域的酶分子的活性部位通常分布在结构域之间的“铰链区”上，有利于结构域发生相对运动，与底物结合,五、三级结构,由于侧链基团相互作用，多肽链进一步折叠或者卷曲构成复杂的空间结构，整个分子成为球状或者颗粒状多肽链上所有原子（包括主链和残基侧链）在三维空间的分布维持三级结构的主要作用力为疏水作用，其次为氢键、离子键、范德华力,疏水 相互作用,静
9、电相互作用,金属离子配位作用,折叠结构链间氢键,螺旋结构链内氢键,二硫键,侧链之间氢键,稳定蛋白质三级结构的主要作用力,鲸肌红蛋白,英国剑桥大学的John Kendrew等人 153个残基分成8段长度为724个氨基酸残基组成的螺旋区，各区之间通过18个松散的残基相连内部疏水，外部亲水,六、四级结构,分子量大的蛋白质由几条多肽链组成，肽链间没有共价键连接，这种肽链称为亚基四级结构指亚基的相互关系、空间排布和特定构象。维持四级结构的作用力主要为疏水作用，其次为氢键、离子键、范德华力；,马血红蛋白,英国剑桥大学Max Perutz经23年研究于1959年提出,七、蛋白质分子中的化学键,肽键二硫键酯键
10、离子键配位键氢键范德华力疏水作用,1、肽键,肽键C-N具有双键的性质，不能自由转动，因此四个原子处于同一平面，H和O呈反式排列C=O双键具有单键性质,2、二硫键,半胱氨酸稳定肽链空间结构二硫键越多，蛋白质稳定性越强例如角蛋白不溶于稀碱溶液,3、酯键,苏氨酸、丝氨酸的羟基与磷酸形成磷酸酯与氨基酸的羧基成酯,4、离子键（盐键）,具有相反电荷的两个基团之间的库仑作用谷氨酸、天冬氨酸的羧基精氨酸、赖氨酸的氨基高浓度的盐、过高或者过低的pH均可破坏离子键，从而使蛋白质变性,5、配位键,两个原子之间形成共价键，共用电子对由其中一个原子提供金属离子和蛋白质的连接螯合剂可除去金属离子导致金属蛋白变性失活,6、
11、疏水作用,非极性侧链（疏水基团）在极性溶剂（水）中为了避开水而彼此靠近所产生的一种作用力本质为范德华力主要存在于蛋白质分子内部,维系一级结构主要作用力：肽键、二硫键维系二级结构主要作用力：氢键维系三级结构主要作用力：疏水作用力维系四级结构主要作用力：疏水作用力,氢键、范德华力、疏水作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力虽然键能小，但数量大二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定,小结,第八节 典型蛋白质的结构,一、角蛋白,-角蛋白毛、发、羽毛、指甲湿热和外力拉直 含丰富的胱氨酸，二硫键-角蛋白蜘蛛丝、蚕丝,二、胶原蛋白,皮肤、软骨的主要成分各肽链为左手螺旋三条肽链缠绕为右
12、手大螺旋含有其它蛋白质中少见的羟脯氨酸（9）、羟赖氨酸,三、血红蛋白,珠蛋白和血红素 血红素的第六个配位键在无氧时与水分子结合生成去氧血红蛋白Hb，在有氧时则与氧结合生成氧合血红蛋白HbO2,第九节 蛋白质结构与功能的关系,蛋白质一级结构对高级结构的影响,一级结构（氨基酸的种类及排列顺序）的改变必然影响高级结构。,1、氨基酸的组成和顺序决定了-螺旋是否存在以及形 成螺旋后的稳定程度例如：多聚赖氨酸；多聚谷氨酸2、R基的大小对多肽链能否形成螺旋有影响例如：多聚异丙氨酸；脯氨酸,蛋白质分子结构与功能的关系（难点）,1、蛋白质一级结构与功能的关系（1）一级结构与生物进化（2）一级结构与分子病2、蛋白
13、质高级结构与功能的关系（1）蛋白质变构与功能的关系（2）蛋白质变性与功能的关系3、蛋白质的激活,（1）一级结构与生物进化,同源蛋白质的研究：也叫同功能蛋白质，有助于研究生物进化。A、同源蛋白质的概念：是指在不同生物体中实现同一功能的蛋白质。它的一级结构中有许多位置的aa对所有种属来说都是相同的，称为不变残基。其他位置的aa差异较大，称为可变残基。这种aa顺序中的相似性称为顺序同源现象。,蛋白质一级结构与功能的关系,牛、猪、羊、人等在中属上差异很大，但它们的胰岛素在一级结构上几乎一致，仅在A链的第8，9，10位上的3个氨基酸有差异。,细胞色素c是一种广泛存在于生物体内，具有铁卟啉的色蛋白（含有1
14、04个氨基酸残基），在生物氧化中起传递电子的作用。120个物种，28个aa位置不变，是维持构象上发挥功能的必要部位。可变残基随进化而变异，亲缘关系越近，aa差异越小。人与黑猩猩大致相同；人与马有12处不同,B、分子进化,（2）一级结构与分子病,一级结构相同，功能相同，一级结构的细小变化导致功能完全不同。A、分子病的概念：由于遗传基因的突变导致蛋白质分 子结构的改变或某种蛋白质缺乏引起的疾病。例如：镰刀性贫血病,举例：分子病镰刀型红细胞贫血症 1910年发现于非洲，40年后搞清病因，一种遗传病。症状：红细胞在缺氧时呈镰刀状，Hb与O2的亲和力改变，红细胞易破裂发生溶血，运氧功能障碍，头昏、胸闷等
15、贫血症状。,病因：血液中血红蛋白异常（HbS），正常：HbA 血红蛋白：两条链和两条链组成四聚体22，链含141AA2，链含146个AA2，总共574个AA。,血红蛋白,HbS与HbA不同：链第6位氨基酸残基异常。HbA：第6位氨基酸为Glu。HbS：第6位氨基酸为Val。链 HbA(正常)：H2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-COOH HbS(异常)：H2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-COOH 除此以外，血红蛋白的其他部分均完全相同，仅此微小差异（574个氨基酸中只有两个氨基酸差异），使HbA和HbS在功能 上表现出很大的差异。,贫血
16、病人：其血红蛋白的-链的58、87位，-链的第63、92位上的任何一个组氨酸被取代，血红蛋白容易氧化成高铁血红蛋白，丧失输送氧的能力。,说明蛋白质结构与功能的相适应性，二者之间有高度统一性。,（3）蛋白质的激活,例如：胰岛素原的激活,体内的某些蛋白质分子初合成时，呈无活性状态，称为蛋白质原.蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子.,蛋白质高级结构与功能的关系,以别构现象为例别构现象：蛋白质由于构象变化而引起分子性质变化从而导致生物功能的变化。,血红蛋白为例：血红蛋白由四个亚基组成的四聚体，四个亚基间以次级链相连，每个亚基含有一个Fe2+。Fe2+能与氧气可逆结合，起运输O2的作用
17、，每个亚基都结合一个O2，每个Hb最多可结合4个O2。,血红蛋白有两种构象状态：T-型构象与氧气亲和力低；R-型构象与氧气亲和力高。当氧气与Hb中的一个亚基结合后引起该亚基构象发生变化，由T R型构象，一个亚基构象的变化又会引起另外三个亚基相继发生变化，亚基间次级键破坏，使Hb整个分子的构象发生变化，使所有亚基都变的适宜与O2结合，Hb与O2结合的速度大大加快。,变构作用：当蛋白质的一个亚基结合氧后，使整个分子发生构象改变，因而对氧的亲和力急剧增加，这种现象称为变构作用。,第十节 蛋白质的性质和测定,一、蛋白质的性质,两性解离和等电点分子量大，大小不等胶体性质沉淀作用变性作用颜色反应,二、蛋白
18、质的测定,双缩脲反应福林酚法考马斯亮兰显色紫外吸收,1、双缩脲反应,肽键,原理,在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红色复合物蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似最大光吸收在540nm，颜色深浅与蛋白质浓度成正比测定范围：110mg蛋白质/mL溶液,2、福林酚法（Lowry法）,在碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复合物；复合物将Folin酚试剂中的磷钼酸磷钨酸还原成蓝色复合物，蓝色程度与蛋白质的含量成正比测量范围：25250g/mL,3、考马斯亮兰比色,1976年由Bradford建立（Bradford法）目前灵敏度最高的蛋白质比色测定法，最低蛋白质检测量可达1g测定快速、简便，完成
19、一个样品的测定，只需要5分钟左右。颜色可以在1小时内保持稳定,原理,考马斯亮兰G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比,4、紫外吸收,蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比，可以进行蛋白质含量的测定。适用于柱层析洗脱液的快速连续检测嘌呤、嘧啶及核酸等物质有干扰,本章总结1,蛋白质的定义20种常见氨基酸、必需氨基酸氨基酸的性质氨基反应（茚三酮、DNFB、PITC）羧基反应、侧链基团反应（用于鉴定）,本章总结2,蛋白质的一四级结构的定义、作用力一级结构的测定步骤和方法（C、N末端氨基酸的测定：DNFB，肼解法）二级结构的种类和特征蛋白质的性质和应用蛋白质的测定,完毕！,
