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1、Western Blotting,蛋白质的分析,实验目的,了解Western blotting的原理及其意义,掌握Western blotting的操作方法。应用Western blotting 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。,实验原理,蛋白质样品经 SDS-PAGE电泳后,凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体(如尼龙膜、硝酸纤维素膜、PVDF膜)上,以膜上的蛋白或多肽为抗原,与相应的第一抗体和酶标记的第二抗体反应,用适当的溶液漂洗去未结合抗体后,置含底物的溶液中培育,显出谱带,即可检测出样品中的特异组分。,操作方法,一电转移 1将蛋白质样品进行
2、SDS-PAGE,待溴酚蓝跑出胶后停止电泳。2载手套切24张定性滤纸和一张PVDF膜,它们的大小应与凝胶的大小相同。在膜的一(左)角作一记号(或剪角),依次序浸入100甲醇10秒,去离子水5分钟,然后与滤纸和海绵(纤维)垫浸泡于转移缓冲液中。3剥胶,并将凝胶裁成合适大小,切角以做记号。,“夹心饼”的制作(1),4.次序:负极(黑孔板)纤维垫-12张滤纸-凝胶-PVDF膜-1-2张滤纸-纤维垫-正极板(白孔板)扣上吊扣插进转膜槽中。,“夹心饼”的制作(2),电转移,按上示意图,接上电源(凝胶一边接负极,PVDF膜一边接正极),恒流电泳2小时,电流为:膜面积(cm2)x2mA。关闭电源,将膜取出,
3、置塑料盒中用丽春红S染色约5分钟,回收丽春红S,然后用蒸馏水洗去背景染料显色,室温稍干燥后观察蛋白带所在位置,然后用TBST浸泡几次,完全洗去丽春红S染料。,封闭与杂交,6.将膜放入塑料盒中,加入20mL封闭液,置脱色摇床中缓慢摇动,室温1小时或4(层析冷柜)封闭过夜。三靶蛋白与第一抗体结合7弃去封闭液,用TTBS稀释试剂B(1:1000),取510mL加入盒中,室温平缓摇动温育1小时。然后尽量回收抗体溶液,-20 保存,可重复使用。用TBST室温洗膜3次,每次10 min15min。,杂交与显色,8.用TBST稀释试剂C(1:1000),混匀后加入盒中,每张膜约510mL,室温摇1小时;9.
4、尽量回收二抗,20C保存;将膜用TBST洗4次,每次1015min.;将膜用TBS洗15min.,配制DAB显迹液,将膜放入显色,随时观察带的出现;蒸馏水洗膜;绍晾干膜,拍照。保存膜于密闭的朔料袋中。,试 剂,1.转移缓冲液:2.9g 甘氨酸(39 mmol/L),5.8g Tris 碱(48mmol/L),0.37g SDS(0.037%),200ml 甲醇(20%),定容至1,000mL;每组用量约500mL。2.封闭液:5%脱脂奶粉,0.02%叠氮钠,溶于TBST溶液中;由试剂盒提供(Blocking Solution VW)3.丽春红S(Ponceaus)染液:0.5g 丽春红S溶于1mL 冰乙酸中,加水至100mL;4.TBST洗膜液:TBS 缓冲液含1%Tween-20;高压灭菌后室温保存。,试 剂,5DAB,试剂盒提供,用前用100mM Tris-HCl(pH7.5)配成5mg/mL。反应液配方(5mL):100mM Tris-HCl,pH7.5 2.5mL 5mg/mL DAB 0.5mL 30%H2O2 2.5uL ddH2O 2mL6TBS:100mM Tris-HCl,0.9%(w/v)NaCl,pH7.5,高压灭菌20 分钟,室温保存。7 SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。,器 材,SDS-PAGE电泳装置一套电转移膜装置抗体-酶反应摇床其它,