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1、遗传毒理学,山西医科大学卫生毒理教研室 郑金平,1、遗传毒理学基本概念2、遗传毒性形成的主要机制3、遗传毒性后果及其遗传毒理学应用4、遗传毒理学研究方法,讲授内容,一、基本概念,遗传毒理学（genetic toxicology）研究环境因素对机体遗传物质和遗传过程的作用,阐明遗传毒性对机体健康的后果及其作用机制,为防止环境因素对遗传物质的损伤、增加生物的遗传负荷，保护生态平衡和人体的健康提供科学依据的一门毒理学分支学科。,（一）遗传毒性的类型,基因突变（gene mutation）染色体畸变(chromosome aberration)染色体结构畸变（structural chromosome
2、 aberration）染色体数目改变（numerical chromosome aberration）DNA损伤,1、基因突变,是指基因在结构上发生了碱基对组成和排列序列的改变1、碱基置换2、移码突变3、三核苷酸重复4、大段损伤,碱基置换 base substitution,转换 transition A-G C-T颠换 transversion A-C T C-A G G-C T T-A G,移码突变 frameshift mutation,碱基插入或缺失 1或非3的倍数-移码 3或3的倍数-整码突变,三核苷酸重复（triplet repeats）,又称三联体重复、三核苷酸扩展即一特定的三
3、联核苷酸扩增，重复数目超过正常数目如：正常人基因中CCG/CCG 三核苷酸正常重复6-54次，而在脆性X综 合症的人体内重复50-1500次。在强直性肌营养不良症、亨廷顿（Huntingtons）病中也有此异常重复,大段损伤 large segment damage,指DNA链大段（数个至数千个碱基）的插入或缺失（可波及两个或数个基因）,基因突变的分类,1.按突变发生原因分类 2.按遗传信息的改变分类3.按突变效应的方向分类4.按基因结构改变类型分类,自发突变诱发突变,点突变移码突变三核苷酸重复大段损伤,同义突变错义突变无义突变,正向突变回复突变,2、染色体结构畸变,染色体畸变:由于染色体或染
4、色单体断裂，造成染色体或染色单体缺失，或引起各种重排，从而出现染色体结构异常的称为染色体畸变或染色体结构畸变断裂剂:凡能引起染色体断裂的物质断裂作用:染色体断裂作用的发生或过程即为断裂作用。,2、染色体结构畸变,染色体型畸变 chromosome-type aberration染色单体型畸变 chromatid-type aberration,染色体结构畸变的类型,裂隙（gap）,断裂（break）,染色体结构畸变类型,1、裂隙(gap)和断裂(break)2、断片(fragment)、微小体(minute body)和缺失(deletion)3、环状染色体(ring chromosome)和
5、无着丝粒环(acentric ring)4、倒位(inversion)5、插入(insertion)和重复(duplication)6、易位(translocation),染色体结构畸变类型,着丝粒融合（centic fusion），又称罗伯逊易位(Robersonian translocation)等臂染色体(isochromosome),3、染色体数目改变,整倍体（euploid）非整倍体（aneuploid）,舟舟,Down氏综合征（21染色体三体综合征）,4、DNA损伤,DNA分子结构的任何异常改变都是DNA损伤。包括DNA分子一级结构脱氧核糖、磷酸和碱基的损伤，DNA分子二级结构、三
6、级结构及其构象动态变化的异常改变。DNA损伤的主要类型有DNA单链断裂、双链断裂、DNA链内（碱基）交联、DNA链间交联、DNA（碱基）与蛋白质的交联以及化学物与DNA碱基间的交联、DNA加合物等。,二、遗传毒性形成机制,1.DNA损伤机制2.遗传损伤与DNA修复3 不以DNA为靶的遗传毒性机制,1.DNA损伤机制,碱基类似物的渗入嵌合剂的致突变作用转座成分的致突变作用碱基的化学修饰作用DNA加合物和交联分子形成甲基化作用DNA构象改变增变基因DNA氧化性损伤,(1)碱基类似物(base analogue)的取代,常见的碱基类似物：5溴脱氧尿嘧啶（5-Brdu）T 2氨基嘌呤(2AP)A,碱基
7、类似物(base analogue)的取代,（2）嵌合剂的致突变作用,有些大分子能以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间，称为嵌入剂(intercalation)。它们多数是多环的平面结构，特别是三环结构，其长度为6.8l02nm，恰好是DNA单链相邻碱基距离的两倍。如果嵌入到新合成的互补链上，就会使之缺失一个碱基；如果嵌入到模板链的两碱基之间，就会使互补链插入一个碱基。无论多或少一个碱基都造成移码突变。吖啶橙acridine、原黄素、吖黄素,（3）转座成分的致突变作用,转座子是存在于DNA上可自主复制和移位的基本单位。转座子的转移过程叫转座哺乳动物的DN
8、A病毒和反转录病毒移码突变基因中断基因失活基因结构改变有害基因,（4）碱基的化学修饰作用,有些化学物可改变DNA碱基的结构而后改变其配对功能而引起突变 亚硝基(HNO2)-氧化性脱氨羟胺(NH2OH)-胞嘧啶衍生物烷化剂-烷基化作用,亚硝基氧化性脱氨,亚硝基氧化性脱氨,亚硝基氧化性脱氨,羟胺-胞嘧啶衍生物,烷化剂修饰,提供烷基氮芥类、乙撑亚胺类、磺酸酯及多元醇类、亚硝基脲类、三氮烯咪唑类和肼类硫酸二甲脂、甲基磺酸脂、乙基磺酸乙脂,（5）DNA加合物和交联分子的形成,加合物（adduct）：指亲电子性化学物与DNA作用形成共价结合物,许多化学诱变剂或其活化物分子上存在一个未配对的外层电子，具有缺
9、乏电子的特点，是亲电子剂（electrophlic reagent），化学性质活泼，极易与蛋白质或核酸等大分子物质中富含电子的分子基团（亲核位点，如-SH、-OH、-N-等）发生共价结合，形成加合物或交联分子,参与形成DNA 加合物的活性化学物,天然或人工合成的化合物：多环芳烃、芳胺、亚硝胺、霉菌毒素、农药、各种烷化剂（烷基硫酸醋、N亚硝基化合物、氮芥和硫芥等环状烷化剂和卤代亚硝基脲等）等内源性：雌二醇等,大加合物代表物：多环芳烃、生物毒素、黄曲霉毒素B和芳香胺类后 果：DNA的立体构象发生明显变化，阻断受损部位 DNA的半保留复制和转录。小加合物代表物：烷化剂、亚硝基化合物后 果：对DNA的
10、构象影响较小，易导致碱基错误配对。,共价结合的位点,DNA加合物的形成并非简单、随机的事件，而要涉及到特定的电子和立体化学结构。化学物质可能在DNA的碱基、磷酸二脂键和戊糖的不同位置上形成加合物,共价结合的位点,碱基易被烷化的位置为鸟嘌呤的N3、N7和O6，腺嘌呤的N1、N3和N7，胞嘧啶的N3和O2，胸腺嘧啶的N3、O2和O4。DNA链上磷酸酯键上的氧也可受到烷化。,A,G,T,C,共价结合的位点,有些诱变剂与DNA共价结合的位置是比较专一的：如乙酰氨基芴（AAF）仅特异地作用与鸟嘌呤的C-8位，烷化剂对于多核苷酸链上的全部氧和氮原子，除连接戊糖的氮以外，均能在中性环境产生烷化作用。但已知N
11、亚硝基化合物主要与氧反应，并多数攻击鸟嘌呤的O6位，而烷基硫酸酯几乎完全与氮反应，并多数攻击鸟嘌呤的N7位。多环芳烃加合物主要形成在鸟嘌呤的C-8位。,形成加合物的后果,1、碱基错配,C：G T：O-6-甲基-G O-6鸟嘌呤烷化后的碱基配对,形成加合物的后果,2、脱嘌呤作用（depurination）如鸟嘌呤的N一7位发生烷化后可导致鸟嘌呤从DNA链上脱落，致使在该位点上出现空缺，即碱基缺失(base deletion)，其结果是移码突变。偶然可能在复制时，其互补位置上随机配上一个碱基，于是导致转换或颠换。,形成加合物的后果,3、DNA链断裂 大的DNA加合物能阻断DNA的复制 DNA加合物
12、可发生在戊糖骨架或磷酸上，造成磷酸二脂键的断裂,形成加合物的后果,4、交联形成 多功能烷化剂常使DNA链内、链间或DNA与蛋白质之间发生交联(cross linkage)。发生交联后的DNA链不易修复或发生易错修复，因而高度致突变；也经常发生染色体或染色单体断裂，并易发生致死性突变。交联也可能继发于脱嘌呤作用。紫外线、电离辐射导致形成嘧啶二聚体,（6）异常甲基化作用,5mC是人基因组中最常见的一种DNA修饰方式。DNA合成完成后不久，在DNA甲基转移酶作用下，以5-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，使合成的DNA进行甲基化修饰。甲基化的维持是调节基因表达的一个重要机制.在人基因组中，有70%-90%的
13、5mC发生在CpG二核苷酸中,5-甲基胞嘧啶（5mC）,CpG在基因组中的分布是非随机的，约15%的CpG发生5mC甲基化。但这些甲基化的CpG一般是分散存在的，而“CpG岛”（约1-2kb长的CG二核苷酸片段，哺乳动物基因组会有约3000个这样的CpG岛，彼此间隔平均约100kb，他的存在一般提示结构基因的起点）一般是不甲基化的。,异常甲基化作用,DNA异常甲基化是人类肿瘤中常见的改变，且广泛参与了肿瘤的发生、发展过程。DNA异常的低甲基化可造成染色体不稳定，促进染色体的断裂、易位和丢失、以及原癌基因的激活；而DNA异常高甲基化主要发生在抑癌基因的启动子区域，是造成基因表达失活的重要机制之一
14、，DNA异常甲基化作为分子生物标志物，在肿瘤的诊断、治疗和预后中均显示出广阔的应用前景,异常甲基化作用,异常甲基化,基因失活,突变热点,直接机制是指Cp G 岛甲基化干扰TF(转录因子)与调控区DNA 的结合。间接机制包括甲基化DNA 结合蛋白与甲基化DNA 特异结合而抑制基因转录及DNA 甲基化改变染色质结构,阻碍TF 与DNA 结合从而抑制转录,异常甲基化作用,异常甲基化,基因失活,突变热点,基因中极易受攻击的位置，其突变频率大大高于平均数，这些位点就称为突变热点(hot spots of mutation)。突变热点并非完全随机分布诱发突变和自发突变中均有突变热点。形成原因：5甲基胞嘧啶
15、(5mC)存在，5mC经脱氨形成胸腺嘧啶。在短的连续重复序列处容易发生插入或缺失突变，突变热点还与突变剂有关,5-甲基胞嘧啶（5mC）,5-甲基胞嘧啶 胸腺嘧啶,脱氨,C：G T：G T：A,转换,CH3,5-甲基胞嘧啶（5mC）,在目前已经报道的880种引起人类遗传病的碱基置换中，有38%的点突变发生在CpG二核苷酸中，且其中有86.6%属于,C T或G A转换，这种突变均由5mc脱氨所致,5-甲基胞嘧啶（5mC）,人体基因组中的突变热点：如白蛋白基因（ALB）-球蛋白基因（HBA）-球蛋白基因（HBB）葡糖-6-磷酸脱氢酶基因（PAH）C蛋白基因（PROC）抗凝血酶III基因（AT3）VI
16、II因子基因（F8）及IX因子基因（F9）等。,（7）DNA的构象改变,乙酰氨基芴（AAF）和N2氨基芴（AF）都作用于鸟嘌呤的C8位形成加合物，但结果有异，AAF主要导致移码，而AF主要导致颠换。发现在形成加合物时AAF插入DNA中，使鸟嘌呤凸出，于是导致DNA双螺旋局部变性，而AF则保持在双螺旋之外，不引起变性。又如，AAF对GGCGCC序列中的某一鸟嘌呤作用形成加合物，则产生-2移码突变的同时还出现该热点（基因中极易受攻击的位置）局部由BDNA（左旋DNA的一种）变为ZDNA（右旋DNA）的构象改变。,（8）增变基因,生物体内有些基因的突变与整个基因组的突变率直接相关。当这些基因突变时，
17、整个基因组的突变率明显上升，因此把这些基因称为“增变基因（mutator genes）”。目前了解的有两类，一类是DNA聚合酶的各个基因。如果DNA聚合酶的3 5校对功能丧失或降低，则使突变率升高而且随机分布。另一类是dam基因和 mut 基因，如果这些基因突变，则错配修复系统功能丧失，引起突变率升高。,（9）DNA氧化性损伤,内源性活性氧、热、辐射、药物、重金属、多环芳烃OH可攻击T的C-5和C-6双键，中间产物可与O2反应生成胸嘧啶乙二醇，阻断DNA复制OH和O2直接与DNA分子反应导致DNA链断裂、碱基修饰和DNA蛋白交联等OH和H攻击糖残基引起DNA的碎裂、碱基丢失、链断裂加成鸟嘌呤生
18、成8-羟基鸟嘌呤,2.DNA损伤与修复,化致突变学的模式：结构损伤 损伤修复 突变固定 突变,（1）光复活（photoreactivztion）,phr基因 TT T T,光裂合酶,长波紫外线和短波可见光,直接修复：针对紫外线损伤产生的胸腺嘧啶二聚体,（2）O6 烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶,“适应性反应”，又称O6 甲基鸟嘌呤修复 甲基鸟嘌呤 鸟嘌呤,O6 甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(甲基鸟嘌呤转移酶,MGMT),可修复：烷基 甲基、乙基、正丙基、正丁基、2-氯乙基、2-羟乙基、异丙基、异丁基,半胱氨酸残基,（3）碱基切除修复（base excision repair,BER）,CpG,G
19、pC,me,TpG,GpC,pG,GpC,T,TDG,pG,GpC,APE1,CpG,GpC,XRCC1,polB,LIG3,CpG,GpC,LIG1-3,XRCC1,polB,TDG,（3）碱基切除修复（base excision repair,BER）,CpG,GpC,me,TpG,GpC,pG,GpC,T,TDG,pG,GpC,APE1,CpG,GpC,XRCC1,polB,LIG3,CpG,GpC,LIG1-3,XRCC1,polB,TDG,主要针对氧化损伤、化学修饰和辐射引起的碱基损伤修复,5-AP内切核酸酶脱氧核糖磷酸酶,主要的DNA糖基化酶,尿嘧啶-DNA糖基化酶错配特异DNA糖
20、基化酶 G/T-错配特异DNA糖基化酶 A/G-错配特异DNA糖基化酶针对烷化碱基的DNA糖基化酶 3-甲基鸟嘌呤-DNA糖基化酶 5-甲基胞嘧啶-DNA糖基化酶,主要的DNA糖基化酶,识别氧化碱基的DNA糖基化酶 胸嘧啶乙二醇-DNA糖基化酶 尿素-DNA糖基化酶 羟甲基尿嘧啶-DNA糖基化酶 5-甲酰基尿嘧啶-DNA糖基化酶 Fpg家族（MutM和Fapy-DNA糖基化酶）oxoG系统（如hOGG1）,(4)核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）,损伤,XPC-hHR23B,XPA,RPA,TFIIH,识别,解旋,切除,ERCC1-XPF,XPG,X
21、PB,XPD,核苷酸切除修复核酸酶,解螺旋酶,POL,LIG3,复制因子C,修复合成,针对引起螺旋变形的DNA损伤如紫外线、苯并a芘、顺铂等引起的化学性加合物,PCNA,DNA聚合酶，,（5）错配碱基修复（mismatch base repair）,错配修复蛋白MutH,MutLMutS,ATP,解旋酶,核酸外切酶,POL3,LIGE,人类：hMsh2,hMsh3,hMsh6 hMIh1,hPms1,hPms2 外切核酸酶1，FEN1 DNA聚合酶，DNA复制因子RPA，RF-C 细胞增殖核抗原PCNA,GATC,GATC,1、识别并除去错配的碱基对2、碱基活性修饰-5mC脱氨基作用3、遗传重
22、组产生的含有错配核苷酸的DNA异源双链,（6）DNA单链和双链断裂的修复,DNA单链断裂：依赖BER后期起作用的同一些酶进行处理和连接。之前，由外切核酸酶切除“擦破”的末端和由DNA激酶使5端磷酸化。多聚（ADP-核糖）聚合酶-1（poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP1）对单链断裂起一过性的保护作用，起到抗重组效应。,（6）DNA单链和双链断裂的修复,DNA双链断裂：1、单链退火 2、非同源末端连接 3、同源重组,非同源性末端连接（NHEJ）,Ku70、Ku80DNA-pkcsXRCC1,DNA-PK复合体将两个断端牵合在一起而促进两相对末端联会，DNA-PK可使
23、结合至相对末端的KU和DNA-pkcs发生反式磷酸化，导致DNA-pkcs解离并激活KU的解旋酶活性，使DNA末端解旋而发生微同源序列配对。-连接 常有短缺失（16个核苷酸）,连接,KU70（XRCC6）KU80（XRCC5）DNA-pkcs（XRCC7）-DNA依存性蛋白激酶,重组修复,RAD52群基因,在人类，已经克隆了5个RAD52 同源基因：hRAD50,hMRE11,hRAD51,hRAD52,hRAD54,XRCC2，XRCC3，hRAD51B,hRAD51C,hRAD51D,hDMC1,（7）复制后修复（post relication repair）,跨损伤的DNA合成 是一种耐
24、受修复，复制时，DNA聚合酶将从DNA上解离而在新合成的链上留下一个缺口，DNA聚合酶跨过损伤合成。缺口通过重组作用及链延长作用填补。DNA损伤依然存在,（7）复制后修复（post relication repair）,SOS修复SOS系统只在细胞受到严重损伤或复制系统受到抑制时才出现 特点：一种旁路系统，允许新生DNA链越过胸腺嘧啶 二聚体而生长；保真度降低；“好死不如赖活着”参与的酶：recA酶 LexA酶这个系统是在DNA分子受到大范围的损伤情况下防止细胞死亡而诱导出的一种应急措施，是使细胞通过一定水平的变异来换取最后幸存手段。借用国际通用的紧急呼救信号（save our souls）“
25、SOS”命名，表示细胞受到危急状态时的修复方式。,修复过程：当DNA两条链的损伤邻近时，损伤不能被切除修复或重组修复，这时在核酸内切酶、外切酶的作用下造成损伤处的DNA链空缺，再由损伤诱导产生的一整套的特殊DNA聚合酶和SOS修复酶类，催化空缺部位DNA的合成，补上去的核苷酸几乎是随机的，但仍然保持了DNA双链的完整性，使细胞得以生存。由于SOS修复是一种错误修复，SOS系统可造成很高的突变率，在哺乳动物中也有类似机制，可能与癌变有关，因此受到高度重视，对于其修复的机制还有许多问题有待于进一步研究。,损伤修复与突变,需要关注的几个问题：1、DNA损伤修复错误错误修复2、DNA损伤修复能力和缺陷
26、DNA损伤修复酶的多态性有害因素对DNA合成和修复酶系统的损害修复酶系统的甲基化3、细胞周期的关卡作用在DNA损伤修复的意义,MGMTERCC1XRCC1XRCC3,细胞周期的关卡作用,DNA损伤关卡 时相顺序关卡1、传感器部分2、制动部分3、检修部分4、处理部分,DNA损伤信号,细胞停滞,DNA损伤修复,凋亡,细胞分裂,G1,G2,G1关卡G2关卡S关卡纺锤体关卡,细胞周期的关卡作用,细胞周期蛋白,依存于细胞周期蛋白的激酶,细胞转录活化因子,3、不以DNA为靶的作用机制,非整倍体和整倍体的诱发对纺锤体的毒作用对DNA合成和修复有关的酶系统的作用修复与突变,非整倍体和整倍体的诱发,不分离 染色
27、体遗失 染色体桥 核内再复制减数分裂,对纺锤体的毒作用,与微管蛋白二聚体结合与微管上的琉基结合破坏已组装完成的微管 妨碍中心粒移动 其它作用,DNA损伤修复的效率,体细胞突变,生殖细胞突变,良性肿瘤,恶性转化,细胞衰老,分化的胚胎细胞受损,未分化的胚胎细胞,显性致死,隐性致死,存活突变,动脉硬化,未知疾病,癌变,老化,出生缺陷(流产/死胎)癌变,出生缺陷(功能或结构畸形),流产死产,出生缺陷基因负荷,先天性疾病,三、遗传毒性的后果,遗传毒理学的应用,1.诱变剂的检测 2.致突变机制研究 3.遗传生物标志物的研究 4.遗传损伤与疾病 5.抗突变研究 6.易感人群的筛查 7.健康危险度的评定,1、
28、诱变剂的检测,化学物质、环境污染物、放射线和放射元素、药物、农药、毒素、食品添加剂、病毒等检测方法研究慢性或低剂量接触条件下DNA损伤,3、遗传损伤与疾病,人类疾病相关基因的识别与鉴定 病变组织？非病变组织致病基因的识别与鉴定 动物模型-基因替代、治疗疾病分子机制的研究 基因结构突变？表达水平改变？病因学研究 诱变因素 致病基因（标志物）,3、遗传损伤与疾病,肿瘤,人类致癌物,癌基因,抑癌基因,增变基因,易感基因,代谢酶基因,修复酶基因,保护性蛋白,3、遗传损伤与疾病,衰老,线粒体DNA突变：缺失突变 氧化性损伤-8-OH-dG增长3倍,3、遗传损伤与疾病,动脉粥样硬化6-磷酸葡糖脱氢酶(G-
29、6-PD)原发性高血压血管紧张素转换酶（ACE）血管紧张素原基因（AGT）-adducin基因 2-类上腺素受体基因 G-蛋白3亚单位基因(GNB3)上皮钠通道亚单位基因(ENaC),3、遗传损伤与疾病,高脂蛋白血症 型 型 型 脂蛋白脂酶(LPL)低密度脂蛋白受体 载脂蛋白E 载脂蛋白C-II（LDLR）非胰岛素依赖型糖尿病 胰岛素基因、胰岛素受体基因 葡萄糖激酶、线粒体tRNA基因,4、生物标志物（Biomarker）,1987年,美国全国科学理事会(NRC)生物标志物委员会将生物标志物描述为反映生物系统或样本中所发生事件(event)的指标，并将其视为研究接触外源化学物与健康损害之间关系
30、的工具。其广义定义为：测定生物系统与外源化学物之间相互作用关系的一种特异测量指标,4、生物标志物（Biomarker）,遗传毒性生物标志物：利用人体不同生物材料反映遗传毒物接触水平、生物学效应和机体对遗传毒物反映能力与水平的生物学标记，就是生物标志物暴露生物标志物效应生物标志物易感生物标志物,暴露生物标志物,用以反映机体生物材料中，外源性化学物或其代谢产物或外源性化学物与某些靶细胞或靶分子交互作用产物的含量。尿1-羟基芘-多环芳烃,效应生物标志物,机体中可测定的生化、生理、行为和其他改变的指标，这些改变与化学物导致的健康效应或疾病相关联 DNA加合物 癌基因 MN 抑癌基因 SCE 特定基因
31、突变？产物 8-OH-dG,易感性生物标志物,反映机体先天具有的或后天获得的对接触外源性化学物产生反应能力的指标 代谢酶基因多态性-CYP1A1，DNA修复损伤修复酶基因多态性-XRCC1,2,3 保护机制多态性-HSP70?,理想的生物标志物的特征,与机制紧密相关敏感性和特异性标准化的方法便于现场使用方法难度非创伤性高通量分析费用适当,5、抗突变研究,抗诱变剂分类（机制）去诱变剂(desmutagen):使诱变剂灭活的物质 生物抗诱变剂(bioantimutagen):干预突变表达的物质,抗诱变剂分类（作用部位）,细胞外作用的诱变剂：阻止诱变剂摄入和形成 灭活已存在的前诱变剂和诱变剂,抗诱变
32、剂分类（作用部位）,细胞内作用的诱变剂 阻止诱变剂到达靶位点或阻止其于靶作用点发生作用 抑制终变剂形成 增强机体解毒酶活性 直接与诱变剂结合 消除已经存在的致突变的自由基 阻止转化细胞表达 阻止突变DNA修复,6、易感人群的筛查,遗传缺陷基因多态性 代谢酶类 修复酶类 免疫类 保护性蛋白类,7、危险度评定（risk assessment）,在人群水平上，定性和定量地评估危害因素导致人类不良健康效应的可能性。主要由四部分组成：危害鉴定、剂量-反应关系评价、接触评定和危险度描述,四、遗传毒性检测方法,1、遗传学终点2、试验组合的原则3、常用的试验方法,1、遗传学终点,试验观察到的现象所反映的事件称
33、为遗传学终点(genetic end point)。,1、遗传学终点,国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)于1983年提出致突变试验的遗传学终点分为五类：DNA完整性的改变（形成加合物，断裂、交联）；DNA重排或交换；DNA碱基序列的改变；（基因突变）染色体完整性的改变；（染色体畸变）染色体分离改变。,2、试验组合的原则,应包含5个遗传终点的原则；包含原核生物与真核生物的原则；包含体内试验与体外试验的原则；包含生殖细胞和体细胞的原则。,3、常用的试验方法,（1）基因突变测试（2）染色体畸变检测（3）DNA损伤标志的检测（4）现代分子生物学技术在基因突变检测中的应用,1、基因突变测试
34、,微生物突变分析 哺乳动物细胞突变分析昆虫突变分析哺乳动物体内突变分析,1、沙门氏菌-组氨酸回复 突变分析(Ames)2、穿梭质粒(XYLE-邻苯二酚氧化酶),细菌回复突变试验（Ames试验）,正向突变野生型菌株（原养型）突变型菌株（组胺酸营 养缺陷型）回复突变 代谢活化系统 受试物 图3-4 Ames试验原理,1、基因突变测试,微生物突变分析 哺乳动物细胞突变分析昆虫突变分析哺乳动物体内突变分析,正向突变分析 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)胸腺嘧啶核苷激酶(TK),哺乳动物细胞正向突变分析,（1）tk基因座（胸腺嘧啶核苷激酶）：基因座位于常染色体，其基因产物为胸苷激酶(TK)。
35、该酶催化胸苷的磷酸化反应，使生成胸苷单磷酸(TMP)，进一步生成DNA复制所必需的胸苷三磷酸。如果存在5-溴尿嘧啶脱氧核苷(BrdU)或三氟胸苷(TFT)等类嘧啶类似物，则产生异常的TMP，而异常TMP的存在将导致细胞死亡。如在受检物存在下，细胞对Brdu或TFT等发生抗药性，则说明tk基因座发生了突变。,哺乳动物细胞正向突变分析,（2）hgprt基因座（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶）(HGPRT)的编码基因hgprt位于人和啮齿动物的X染色体。由于X染色体在雌性有一条处于失活姿态，所以hprt基因座在雌雄两性是分别处于功能上的和结构上的单倍状态。HPRT催化次黄嘌呤和鸟嘌呤生成相应的核苷单磷
36、酸（NMP），后者进一步合成DNA。如在6-巯基嘌呤（6-MP）、6-硫代鸟嘌呤（6-TG）或8-氮杂鸟嘌呤（8-AG）等嘌呤类似物，则以这些物质为底物生成相应的NMP，这些异常NMP的存在将导致细胞死亡。如受检物使hprt基因发生突变而失活（hprt-），细胞中的HPRT活性将大为下降，于是使细胞发生对嘌呤类似物的抗性。,哺乳动物细胞正向突变分析,gpt基因座即xprt基因座，其基因产物可催化黄嘌呤（xanthine）和鸟嘌呤产生NMP。当6-TP等嘌呤类似物存在时，生成的异常NMP使细胞死亡。如受检物的存在下能使细胞对嘌呤类似物发生抗性，则可说明gpt基因座发生了突变。,1、基因突变测试,
37、微生物突变分析 哺乳动物细胞突变分析昆虫突变分析哺乳动物体内突变分析,小鼠特异性基因座测试（SLT）小鼠体细胞皮毛斑点突变分析转基因动物,转基因动物,转基因动物是指基因组中整合有用实验方法导入的DNA（可以是完整的基因，也可以是完整的DNA片段），并能遗传给后代的动物。目前，用于致突变作用研究的转基因动物主要有商品化的BigBlu小鼠和MutaMouse小鼠。BigBlu小鼠以大肠杆菌LacI为靶基因，MutaMouse小鼠以大肠杆菌LacZ为靶基因。,转基因动物,1、基因导入导出模型（Lac I,LacZ）2、穿梭质粒模型(Puc118，pESnx质粒，邻苯二酚氧化酶基因xylE靶基因，亚硝
38、基胍为诱变物，靶基因突变和外周血、骨髓微核分析为终点)3、基因敲除模型,2、染色体畸变检测,染色体畸变分析微核试验显性致死试验 荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）,荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）,它是利用一系列诸如由DNA重复序列、寡核苷酸片段构成的探针以及从染色体文库中构建的涂染探针（painting probe），可以识别中期和间期细胞中的特异染色区域。,微核试验(micronucleus test),进展：1、双核微核试验 2、图像分析系统 3、使用细胞材料
39、的扩展,微核试验(micronucleus test),细胞松弛素B阻止细胞分裂,微核试验(micronucleus test),动物：骨髓嗜多染红细胞、胚胎细胞、各种脏器细胞人血淋巴细胞、头毛囊细胞、痰液细胞、支气管肺泡灌洗液细胞、泌尿道上皮细胞、宫颈上皮细胞、口腔粘膜细胞、鼻腔粘膜细胞蚕豆根尖细胞、紫露草雄蕊毛细胞,3、DNA损伤标志的检测,1.单细胞凝胶电泳（single-cell gel electrophoresis,SCGE）2.H2AX的检测3.程序外DNA合成试验4.DNA修复检测5.DNA加合物的测定6.姐妹染色单体交换试验7.精子畸形试验,（1）单细胞凝胶电泳,单细胞凝胶电
40、泳技术(single cell gel electrophoresis,SCGE)，也称彗星试验(comet assay)可以检测DNA单链和双链断裂,（1）单细胞凝胶电泳,当细胞DNA 受损产生链断裂时，DNA 的超螺旋结构受到破坏。在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内蛋白质、RNA 及其它成分均可进入凝胶而扩散到裂解液中，而核DNA 分子量很高不能进入凝胶，只能留在原位。在碱处理和碱性电泳液的作用下DNA 解螺旋，使DNA 的断链和碱易变性DNA 片断从超螺旋结构中释放出来。这些DNA 断链分子量较小且碱变性为单链，在电泳电场中就可以离开核DNA 在凝胶分子筛中向阳极移
41、动，形成慧星状图象。DNA 受损伤愈严重,产生的断链和碱易变性片断就愈多,断链也愈小;在相同电泳条件下迁移的DNA 量就愈多,迁移的距离就愈长。因此,通过测定DNA 迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定DNA 损伤程度,确定电离辐射或其它因素作用剂量与DNA 损伤效应之间的关系。,（1）单细胞凝胶电泳,检测指标：尾长、尾矩、olive尾矩分析软件：CASP软件,低暴露组：出现拖尾细胞,正常组：淋巴细胞核完整，无拖尾,高露组：细胞拖尾严重,（2）H2AX的检测,DNA双链断裂(DNA double stranded breaks,DSBs)发生后，产生一系列的应激反应，其中一个主要的反应就是毛
42、细血管共济失调突变基因(ATM)起始的信号级联反应，它使细胞周期停顿直到损伤修复。H2AX是这一信号级联反应中的一个主要成员，它能被ATM磷酸化(称为H2AX)。H2AX在DSBs位点形成焦点，并进一步募集一些损伤修复相关蛋白，如BRCA1、53BP1、Rad50和NBS1等，对DSBs进行修复。由于H2AX的出现与DSBs紧密相关，且存在着一一对应关系，H2AX也被认为是检测细胞DNA双链断裂的一个新的特异性指标。H2AX与公认的反映DNA双链断裂的彗星试验具有很好的相关性。,（2）H2AX的检测,免疫荧光：直观、形象。在不同的研究中，镜下观察得到的H2AX焦点的大小和荧光强度在不同的条件下
43、可能发生变化流式细胞术：结果比较客观、准确，统计学精度也比较高，能进一步结合细胞周期来分析H2AX含量的变化。但是，不能从单细胞角度分析H2AX焦点的形成情况。免疫印迹：所需要的设备要求低，极易开展工作。它只能检测到H2AX含量的变化，其他功能方面都不如免疫荧光技术或 FCM。,（2）H2AX的检测,DNA加合物常用检测方法比较方法灵敏度(加合物/108核苷酸)每次分析所需DNA量(g)荧光法 同步荧光法310501000 低温激光法10100100 激发发射荧光法10100100 色谱质谱法 色谱质谱法 0.11 502000 加速器质谱法0.00010.001 0.0010.01 免疫法
44、免疫法101002560 放射免疫法110505000 竞争性酶联免疫法10 50 非竞争性酶联免疫法101000.11 超敏酶促放射免疫法0.51 2550 32P后标记法 32P后标记法 0.10.01 110,3.DNA加合物的测定,（1）32P-后标记法 将DNA提纯、消化，用磷酸酶P1选择性地使3端去磷酸化，带有加合物的核苷酸不发生反应可被32p ATP标记，用薄层层析和放射自显影定量分离。,3.DNA加合物的测定,（2）免疫法 是基于抗原抗体特异性反应形成免疫复合体的原理 竞争性放射免疫测定(R IA)酶联免疫吸附测定法(E L I S A)超敏酶促放射免疫测定(U S E R I
45、A)免疫组化,4、单核苷酸多态性分析（single nucleoride polymorphism,SNP）,未知突变：1、PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）2、变性梯度凝胶电泳（DGGE）3、变性-高压液相色谱分析（DHPLC）4、DNA芯片5、直接测序法6、飞行质谱仪(MALDI-TOFMS)检测,单链构象多态性(SSCP),原理：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分子依其单碱基序列的
46、不同而形成不同的构象，这样在凝胶上的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。,PCR-SSCP,变性高效液相色谱(DHPLC),原理：目标核酸片段PCR扩增，部分加热变性后，含有突变碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来,从而达到分离的目的。SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰形或数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的碱基。特点：使用高效液相色谱检测SNPs
47、具有检测效率高，便于自动化的优点，对未知SNPs的准确率可达95%以上。但DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高,容易产生误差,不能检测出纯合突变。,MALDI-TOF,原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物共价结合后,在硅芯片上进行引物的退火,延伸反应,突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。,4、单核苷酸多态性分析（single nucleoride polymorphism,SNP）,已知突变点限制性内切酶片断长度多态性（PCR-RFLP）实时荧光PCR分析分子信标技术DNA芯片,限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）,HSP70-HOM基因PCR片段长度为878bp T/T基因型携带者为551、327bp2个片段（泳道3、4、5）T/C基因型为878、551、327bp3个片段（泳道1、2）C/C基因型仅878bp一个片段（泳道6、7,实时荧光PCR分析,使用针对核酸中不同多态性序列的荧光Taqman探针，它们在PCR扩增中被水解释放荧光信号，只有与靶序列完全匹配的探针才能被相应的切割。不同探针标记不同的荧光报道信号。利用多通道荧光PCR仪检测结果，可以便捷判断核酸多态性。,实时荧光PCR分析,实时荧光PCR分析,谢谢！,
