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1、第四章 酶的提取与分离纯化,将酶从细胞或发酵液中取出，再与杂质分开，获得所需的酶产品。酶的分离纯化工作,是酶学研究的基础.酶的纯化过程就目前而言,还是门实验科学.,酶的纯化过程与一般蛋白纯化过程相比有本身独有的特点:一是特定的一种酶在细胞中含量很少;二是酶可通过测定活力的方法加以跟踪.,1、建立一个可靠和快速的测活方法；2、酶原料的选择；3、酶的提取；4、酶的提纯；5、酶的纯度检验。,酶分离纯化的一般原则:,第一节 细胞破碎（link)第二节 酶的提取(link)第三节 沉淀分离(link)第四节 离心分离第五节 过滤与膜分离 第六节 层析分离第七节 电泳分离 第八节萃取分离 第九节 酶的结晶
2、 第十节 浓缩与干燥,本章主要内容:,go,第一节 细胞破碎,一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。,细胞的破碎方法：一、机械破碎法 二、物理破碎法 三、化学破碎法 四、酶学破碎法,back,原理：机械运动所产生的剪力作用于细胞1 机械捣碎法：捣碎机
3、，10000rpm，实验、生产规模 均可2 研磨法：研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器械，效率较低3 匀浆法：匀浆器，用于颗粒细小的组织细胞 破碎程度高。对酶破碎少，难于工业化。,Back,一、机械破碎法,包括:1、温度差破碎法;2、压力差破碎法;3、超声波破碎法;,二、物理破碎法,通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组织细胞破碎,1、温度差破碎法,冷冻 高温，用于脆弱易破菌，难以工业化;于冷藏库或干冰反复于零下1520使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂
4、蛋白冻结变性。或:将材料投入沸水中，于90左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。,2、压力差破碎法,高压冲击法用活塞或冲击锤加高压冲击菌体细胞和冰晶石英沙等混合物。突然降压法加压至30MP以上，打开出口阀突然降为常压爆破性减压法用氮气或二氧化碳充压至几十至几百大气压。渗透压差法利用渗透压的变化而使细胞破碎，常用于从海洋微生物中提取某些酶。,频率 1020KHz，功率100150W，温度010oC，pH47，时间310min，间隔多次;对数生长期细胞，细胞浓度和溶液粘度不宜太高。暴露于910kHz声波或10500kHz超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便.且效果也
5、好，但一次处理量较小;应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在;处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。,3、超声波破碎法,在超声波的作用下，细胞膜由于空穴作用而破碎。破坏程度与输出功率、破碎时间密切相关，与频率关系不大。,操作条件,Back,三、化学破碎法,应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏。,有机溶剂（如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。,1、有机溶液,粉碎后的新鲜材料在0以下加入510倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉
6、末。用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。,操作,表面活性剂(溶于液体后，具有使表面张力显著降低作用的物质)和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。离子型表面活性剂会使酶的结构破坏，不用之。常用的非离子型表面活性剂为：Triton(辛基酚聚氧乙烯醚,聚乙二醇辛基苯基醚);Tween(聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯,吐温,聚氧乙烯山梨醇酐三硬脂酸酯)用凝胶层析等方法除去表面活性剂，以便酶的进一步纯化。对膜结合酶的提取特别有效。,2、表面活性剂,Back,四、酶学破碎法,在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用，使细胞破碎。,简单原理:溶菌酶处
7、理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量高，而多易结晶化。,1、外加酶,1g菌体加110mg溶菌酶，pH6.27.01h内完全溶菌。于生理食盐水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出。蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。革兰氏阳性菌：细胞结构和形状依赖于壁上的肽多糖，溶菌酶能专一性作用于肽多糖的-1，4-糖苷键。革兰氏阴性菌：除了溶菌酶外，另加EDTA才有效。酵母：其细胞壁的主要成分是-1，3-葡聚糖，需加-葡聚糖酶；霉菌：其细胞壁含有几丁质，可用几丁质酶；植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。,将待破碎的鲜材料在一定p
8、H和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。于温室30左右较早溶化。自体融解过程中PH显著变化，随时要调节pH。自溶温度选在04，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。适宜的自溶条件：温度、pH值、离子强度等加入噬菌体感染细胞电离辐谢,2、自溶法,Back,第二节 酶的提取,是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。也称酶的抽提。目的:让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白
9、质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶剂。,盐溶现象:在一定浓度的盐存在下,酶的溶解度增加.盐析现象:当盐的浓度太高,蛋白的浓度反而下降,从溶液中析出.一般采用稀盐溶液，0.020.05mol/L。等渗盐溶液尤以0.020.05mol/L磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。0.15mol/L氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L碳酸氢钠液提取等。,一、酶提取的主要方法,1、盐溶液提取,蛋白质提取液的pH值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋白质
10、的溶解度，提高提取效果。,酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶液提取。,2、酸溶液提取、碱溶液提取,原则：,如细胞色素C属碱性蛋白质，常用稀酸提取；肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱提取；某些蛋白质或酶与其分物质结合常以离子键形式存在，选择pH36范围对于分离提取是有利的。,与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶需用有机溶剂提取。有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。一些和脂结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取。例:从一些粒线体（Mitochondria)及微粒体（Microsome)等含多量脂质物质中
11、提取蛋白质时，采用Morton的丁醇法效果较好。因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10%，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。,3、有机溶剂提取,二、影响酶提取的主要因素,1、温度,为了防止酶变性失活，温度不宜高；多数酶的提取温度在5以下；耐温较高的酶可适当提高温度，以提高酶溶解度和扩散速率。少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化。如胃蛋白酶等及许多多肽激素类，选择3750条件下提取，效果比低温提取更好。,2、pH值为了防止
12、酶的变性，pH不宜过高或过低；溶液的pH值应远离酶的等电点，以增加酶的溶解度。3、提取液的体积提取液的用量增加，可提高提取率；过量，酶浓度降低，不利进一步纯化。,从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两步进行。,蛋白质（酶）的分离纯化,蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。性质 方法分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤 溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀电荷 电泳、离子交换层析吸附性质 吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析）对配体分子 亲和层析
13、 的生物亲和力,主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低.,1、粗分级分离,2、细分级分离,一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率的柱层析及电泳方法。常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析。常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳。另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。,Back,第三节 沉淀分离,改变某些条件，使溶液中某种溶质溶解度降低，从而从溶液中
14、沉淀析出，达到与其它溶质分离。是酶分离纯化常用的方法之一。其本质是降低溶液的溶解度。方法有盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、复合沉淀等,表4-3.,在某一浓度的盐溶液中，不同的蛋白质和酶因溶解度各不相同而分离。盐为什么会改变蛋白酶的溶解度？盐在溶液中离解为正负离子，反离子作用改变蛋白酶分子表面的电荷；同时离子存在改变水活度使分子表面水化膜改变。,一、盐析沉淀法,盐溶是加盐使蛋白质融入水中，盐析是加盐使蛋白质沉淀出來。两者所加的盐类不同，其作用机制也毫无关系。,在低盐浓度下,蛋白质和酶溶解度随盐浓度升高而增加,盐溶,盐析,盐浓度升高到一定浓度后,蛋白酶的溶解度又随着盐浓度升高而减少,蛋白酶沉淀
15、析出.,一旦蛋白质溶液加入硫酸銨，后者吸引了大量水分子，使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的吸引，因而沉淀下來。因此，分子表面上若有越多的非极性区域，就越容易用硫酸銨沉淀下來。,式中：S、So：蛋白质或酶在离子强度为I和0时的溶解度（g/L）Ks：盐析常数，取决于盐的性质和酶的结构I：离子强度,与离子浓度mi和离子价数Zi有关。I=1/2miZi2,酶在溶液中的溶解度与溶液中的离子强度的关系式：,蛋白质和酶在溶液中的溶解度与溶液中的离子强度有密切的关系,=LogSo：取决于酶的性质，也与温度和pH有关。Ks：主要取决于盐性质。与离子价数成正比，与离子半径与溶液介电常数成反
16、比。与Ks确定后，蛋白酶溶解度决定于IKs分段盐析:T、pH一定下改变离子强度分段盐析:一定盐和离子强度下，改变T、pH常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。盐析所需添加饱和硫酸铵体积式：,温度和pH一定时，So为常数，,不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：,血清,球蛋白,清蛋白,(NH4)2SO4,50%饱和度,饱和,析出,析出,分段盐析,常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起
17、蛋白质活性丧失。盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能进一步精提纯。脱盐常用透析法。,透析是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜（玻璃纸、火绵纸等）制的透析袋里放在蒸馏水中进行，可不断更换蒸馏水，直至杂质被除去。,透析袋,蛋白质溶液,蒸馏水,利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质（如酶、蛋白质、氨基酸等）具有不同的等电点这一特性进行分离纯化的方法。等电点时，分子表面的水膜仍然存在，使酶和蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全。故常用于粗酶液中除杂和与其它方法联系使用。,二、等电点沉淀法,图例,介电常数 溶质分子之间的引力 溶解度有
18、机溶剂 溶质分子周围的水膜破坏 酶和蛋白质的氢键破坏 空间结构变化 形成疏水层,三、有机溶剂的沉淀法,利用酶等物质在有机溶液中的溶解度不同而使之分离的方法。,介电常数permittivity 亦称相对电容率。是指在同一容器中用某一物质为电介质和真空时的电容的比值。介电常数通常随温度和介质中传播的电磁波的频率而变。电介质的介电常数越大，极化能力越强；介电常数越小，绝缘性能越好。用r表示,（1）所析出酶沉淀比盐析法析出的易于 离心分离或过滤；（2）不含无机盐，适于食品工业用酶制 剂的制备；（3）易于除去或回收。,优点：,缺点：,易于引起酶的变性失活，需低温操作和沉淀析出后尽快分离。,酶+酶沉淀剂
19、复合物沉淀 分离 从复合物中析出酶,四、复合沉淀法,常用的酶沉淀剂：单宁（加入量为酶液的0.11%。）聚丙烯酸（3040%）等高分子聚合物,五、选择性变性沉淀,使杂蛋白变性沉淀，而酶不受影响；热稳定性好的，可进行热处理；改变pH或加入某些金属离子使杂蛋白除去；,back,第四节 离心分离,离心：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、密度的物质分离的技术；要根据欲分离物质及杂质的大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。,1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g以下,用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等分离；2、高速（冷冻）离心机 1
20、104-2.5104rpm，相对离心力104105g,用于沉淀、细胞器等分离；3、超速离心机 转速2.5-8104rpm，相对离心力5*105g；用于DNA、RNA蛋白质及细胞器病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。分制备用、分析用、制备及分析用三种。分析用超速离心机装有光学检测系统、自动记录系统、数据处理系统；,一、离心机的种类与用途,台式高、超速离心机0.6-10万转/分以上,(分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉降特征和结构等),概述,所分离的颗粒大小和密度相差较大:常速、高速离心;若从样品液中分离2种以上大小和密度不同的颗粒：差速离心;超速离心:差速离心法和密度梯度离
21、心法，后者又分速率区带离心和等密度离心。,二、离心方法的选用,1、差速离心,采用不同离心速度与时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离；,100 000g,3h,2、密度梯度离心,又称速率区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法；原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度；操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密
22、度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带；可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分,3、等密度离心,原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离；区别:离心介质、密度梯度范围与密度梯度离心不同，欲分离的颗粒密度处于离心介质密度范围内。介质有：氯化铯、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。操作：介质溶液与样品液混合均匀，足够时间离心。介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。常用来分离提取核酸、
23、亚细胞器和质粒。,低速离心用rpm表示，高速、超高速离心用相对离心力（RCF）表示。,三、离心条件的确定,1、离心力,离心力,离心加速度,相对离心力（RCF）,2、离心时间,不同离心方法，离心时间的概念不同。对常数离心、高速离心、差速离心,指颗粒完全沉降到离心管底的时间,沉降时间或澄清时间;等密度梯度离心,指颗粒完全到达等密度点时平衡时间，平衡时间;对密度梯度,指形成界限分明区带的时间，区带形成时间;,沉降时间,沉降系数已知颗粒,效率因子K,S：沉降系数；:角速度；r1，r2:转轴中心到液面与管底距离。,K与转子半径和转速有关；实际操作中：1，某一颗粒S定值，故K小，t也小，效率高（转子的选择
24、）；2,转子与离心机确定，具体颗粒而言，2t是常数，故可调整与t得相同效果。,指颗粒从样品液面完全沉降到离心管底所需的时间;决定于沉降速度和沉降距离。,一般为4oC。稳定性好的酶，可取室温；超高速离心需冷冻。pH值应处于酶稳定的pH范围。,3、温度和pH值,第五节 过滤与膜分离,过滤 借助过滤介质将大小不同，形状不同的物质分离的技术介质有滤纸、纤维、陶瓷、高分子膜等。以膜为过滤介质的过滤称膜分离技术；微滤、超滤、反渗透、透析、电渗析都属于膜分离技术,表4-4 过滤的分类与特性（P112）,一、非膜过滤,截留颗粒直径大于2m,用于分离酵母、霉菌、动植物细胞、培养基残渣等。过滤介质有滤纸、滤布、多
25、孔陶瓷等。(1)常压过滤以液位差为推动力，易操作，分离效果差，难成规模。(2)加压过滤以压力泵或压缩空气为推动力。效果较好，生产上应用广泛。(3)减压过滤真空过滤、抽滤。多用于粘性不大的物料。,1、粗滤,2、微滤,微孔过滤,截留颗粒直径0.22m，光学显微镜可见颗粒，采用微孔陶瓷、微滤膜等。,二、膜分离技术,借助于一定孔径的各种高分子薄膜，将不同大小、不同性状和不同特性的物质颗粒或分子分离的技术。薄膜有丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素、赛璐玢及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。,以薄膜两边的流体静压差为推动力；根据截留的颗粒大小可分为3种；,MEF微滤器,根据颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力不同
26、分三类。,（1）微滤,截留的物质颗粒直径为0.22um，操作压力0.1MPa以下。,1、加压膜分离,(2)超滤,截留的物质颗粒直径为202000（0.2um）；可同时截留菌丝体和可溶性蛋白。操作压力50700KPa；特别适于液体酶制剂的生产；对需要辅酶的酶的生产不适用；,SHM系列膜分离装置,【截留分子量】：30050000道尔顿；【操作压力】：0.10。2Mpa【操作温度】：2050。,在发酵行业中，由于传统分离工艺技术条件的限制，预处理中常有5-15%的产品损失，大量的可溶性蛋白、大分子杂质被带入到下游工序，增加了后提取工艺的环节和负荷，影响产品质量及生产收率。Ultra-flo超滤分离技
27、术彻底突破这一技术瓶颈。,(3)反渗透,反渗透（RO）是膜分离技术的一个重要组成部分 膜孔径小于20，操作压力为0.713MPa。用于海水淡化。在水过滤时利用反渗透膜的选择性透过原理，通过设备的高压泵对经过反渗透膜的原水施加一定压力，在压力作用下原水中的水分子可以透过膜而渗析出来，而其他无机盐、微生物与有机物等却由于反渗透膜对这些物质的截留特性而不能透过膜，从而可以获得纯净的无离子水。,（2）离子交换膜电渗析,2、电场膜分离,在半透膜的两侧分别装上正负极，电场作用下小分子带电物或离子向与其本身电荷相反的电极移动，透过半透膜，达到分离目的。,（1）电渗析,样品液,缓冲液,如图,离子交换膜代替一般膜,主要指透析；利用小分子扩散作用透过半透膜，而大分子被截留；用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的分离。透析设备简单，但操作时间长，要更换水或缓冲液。,3、扩散膜（透析）膜分离,膜公司网站,Back,
