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1、仪器分析课程,Chapter 14 High Performance Liquid Chromatography,第十四章 高效液相色谱法,14.1 概述,高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法,一、HPLC与经典LC区别二、HPLC与GC差别三、特点,14.1.1 HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n）分析周期长 无法在线检测2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱）高压输送流动
2、相 柱效高（H，n）分析时间大大缩短 可以在线检测,14.1.2 HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%,续前,2流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选
3、择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性,3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,续前,14.1.3 HPLC的特点和应用,“三高”“一快”“一广”,高柱效n=104片/米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）,14.2 高效液相色谱仪,14.2.1 流程图,1.贮液瓶,贮液瓶用于存放溶剂。溶剂必须很纯，,对溶剂呈惰性，,采用耐腐蚀的玻璃瓶或聚四氟乙烯瓶。,贮液瓶应配有
4、溶剂过滤器，以防止流动相中的颗,泵内。溶剂过滤器一般用耐腐蚀的镍合金,小一般为2m。,贮液瓶要耐腐蚀，,粒进入,制成，空隙大,为了防止流动相从色谱柱内流出时压力降低，释放出气泡进入检测器而使噪声剧增，要求贮液瓶中的溶剂在使用前先进行脱气。常用的脱气方法有低压脱气法、吹氦气脱气法、加热回流法及超声波脱气法等。,2.高压泵,由于液体的粘度比气体大 102 倍，而且固定相的颗粒极细，对流动相有很高阻力，为保证一定的流速，必须借助高压迫使流动相通过柱子。,高压泵应具备以下特点：耐高压（4050MPacm-2）、耐腐蚀、密封性好；脉动小，送液量稳定，流量范围广(0.110mLmin-1)；适于进行梯度洗
5、脱；泵腔的体积小，便于快速更换溶剂。,泵的柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液器中的液体吸入缸体。如此前后往复运动，将流动相源源不断地输送到色谱柱中。将两个柱塞往复泵串联，可达到无脉动溶剂输出。,分为恒压泵和恒流泵,多用柱塞往复泵,柱塞往复泵,3.梯度洗脱装置,梯度洗脱是流动相中含有两种或两种以上不同溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流动相的组成，使强烈滞留的组分不容易残留在柱上，因而可保持柱的性能良好。HPLC有等梯度洗脱和梯度洗脱两种洗脱方式：前者保持流动相组成配比不变，后者则在洗脱过程中连续或阶段的改变流动相组成，它需要配有梯度淋洗装置。,梯度淋洗,低压梯度,高压梯度,外梯
6、度，特点是先混合后加压,内梯度，特点是先加压后混合,4.进样系统,1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室）,GC系统压力较小，可以,HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）,2）阀进样：不必停泵，六通阀,(a)准备状态,(b)进样状态,进样器的阀体使用不锈钢材料，旋转密封部分由坚硬的合金陶瓷材料制成，既耐磨、密封性能又好。,由于进样可由样品定量环的体积严格控制，因此进样准确，重复性好，适于作定量分析，更换不同体积的样品定量环，可调整进样量。,5.色谱柱,直径45mm,柱长1025cm。,柱效高、选择性好、分析速度快。,柱效评价：,柱再生：维护、保养、柱子的冲洗,1）紫外检测器（UVD）：适于吸
7、收紫外光的物质 样品组分通过流通池时对特定波长紫外线的吸收，引起透过光强度的变化，而获得浓度时间曲线。样品浓度与吸光度的关系服从朗伯比耳定律。最低检出浓度可达10-10gmL-1；2）荧光检测器（FD）：只能分析自身发光的物质 最小检测浓度可达0.1ngmL-1；3）示差折光检测器（RID）：利用折光率的差别，灵敏度低，分析高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等。检测限可达10-610-7gmL-1；4）光电二极管阵列检测器（PDAD）,6.检测器,14.3 高效液相色谱的固定相,14.3.1 液-固吸附色谱法固定相,采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、活性炭等。,基体是实心玻璃珠，在玻璃珠表面覆盖一
8、层多孔活性材料如硅胶、分子筛、聚酰胺等，制成孔径均一，渗透性好，传质速度快新型固定相,1.表面多孔型固定相,2.全多孔微粒固定相,由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成颗粒10m 以下均匀多孔球体，其颗粒小、传质距离短而n高。已成为高效液相色谱柱填料的主体而广泛应用。,液-液色谱法的固定相是由固体载体上涂渍极性或非极性固定液制成的。液-液色谱法及离子对色谱法所用载体可分为以下三类:,14.3.2 液-液色谱法及离子对色谱法固定相,由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成颗粒均匀的多空球体，适合复杂混合物分离及痕量分析。,1.全多孔型载体,2.表面多孔型载体（薄壳型微珠担体）,现采用30-40m玻璃微球，表面附着
9、一层厚度1-2m的多孔硅胶。传质速度快，重现性好，但比表面极小，柱容量低。,3.化学键合固定相,硅胶为载体，利用硅胶表面的硅醇基（Si-OH）与有机分子成键，利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一的、牢固的单分子薄层而构成各种性能的固定相。,硅酸酯型（=Si-O-C=）键合相,硅氮型（=Si-N=）键合相,硅碳型（=Si-C=）键合相,硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）键合相,将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应，在硅胶表面形成（=Si-O-C=）键合相。反应生成单分子层键合相。一般用极性小的溶剂洗脱，分离极性化合物。,如果用SOCl2将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），再与各种有机胺
10、反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。可用非极性或强极性的溶剂作为流动相。,将硅胶表面氯化后，使Si-Cl键转化为Si-C键。在这类固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。,将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合相具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最为广泛的键合相。,功能基团的引入方法,-C4,-C8,-C18-C6H5,-CN,-NH2-SO3H,-COOH,-NR4Cl-,常用键和基团,化学键合相具有以下特点:,1）不易流失，化学性能和热稳定性好；,4）选择性好。,3）表面较为均一，柱效高，载样量大；,2）适于梯度洗脱；,14.3.3 离子交换色谱法固定相,离子交换色谱常
11、用的固定相为离子交换树脂。,按结合的基团不同 离子交换树脂可分为：阳离子交换树脂 阴离子交换树脂,阳离子交换树脂上具有与阳离子交换的基团。阳离子交换树脂又可分为强酸性和弱酸性树脂。磺酸基-SO3-H+为强酸性，其中-SO3-和有机聚合物牢固结合形成固定部分，H+是可流动的能为其它阳离子所交换的离子；羧基-COOH 为弱酸性树脂。,阴离子交换树脂具有与样品中阴离子交换的基团。阴离子交换树脂也可分为强碱性和弱碱性树脂。季胺基-NR3Cl为强碱性；胺基-NH2为弱碱性。,14.3.4 空间排阻色谱法固定相,空间排阻色谱常用固定相有软质、半硬质、硬质凝胶三大类。,1.软质凝胶 如葡萄糖凝胶、琼脂糖凝胶
12、和聚丙烯酰胺，都具有较小的交联结构，属均匀凝胶。此类凝胶在施加压力下特别不稳定，只能在低柱压、低流动相的洗脱流速下操作，且其微孔能吸入大量的溶质溶胀到它们干体的许多倍，它们仅适用于中、低压色谱，不适用于高柱压。,2.半硬质凝胶 如苯乙烯-二乙烯苯交联共聚物凝胶，能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱效较高。但在有机溶剂中有轻度膨胀，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂。,3.硬质凝胶 具有一定孔径范围的多孔性凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃珠等，此类凝胶化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度
13、分布，但装柱时易碎，不易装紧，柱效较低。,14.4 高效液相色谱的流动相,14.4.1 流动相的选择,(1)流动相应不改变填料的任何性质。,(2)流动相应该高纯度。,(3)必须与检测器匹配。,(4)粘度要低。,(5)对样品的溶解度要适宜。,(6)应选用挥发性溶剂，使样品易于回收。,1、反相键合相色谱,1）分离机制：疏溶剂理论 正相流动相与溶质排斥力强，作用时间 k，组分tR 反相流动相与溶质排斥力弱，作用时间，k，组分tR2）固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱HPLC约80%问题）3）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 固定相极性 底剂+有机调节剂（极性调节剂）
14、例：水+甲醇，乙腈，THF,14.4.2 正相分配色谱和反相分配色谱,续前,4）流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，k，组分tR5）出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱6）适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）,2、正相键合相色谱,1）分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力2）固定相：极性大的氰基或氨基键合相3）流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂 例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇,续前,4）流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，组分tR，k5）出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱6）适用：氰基键合
15、相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等,14.5 定性和定量分析,14.5.1 定性分析,1.利用已知标准样品定性,2.利用光电二极管阵列检测器扫描定性,3.两谱联用鉴定法,14.5.2 定量分析,1.外标法,2.内标法,14.6 高效液相色谱法的应用,14.6.1 在食品分析中的应用,食品分析分三个方面：（1）食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、维生素、有机酸等；（2）食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等；（3）食品污染物分析：霉菌毒素、农药残留、多环芳烃等。,14.6.2 在环境分析中的应用,高效液相色谱法适用于对环境中存在的高沸点有机污染物的分析，如大气、水、土壤和食品中存在的多环芳烃（多为致癌物质）、多氯联苯、有机氯农药、含氮除草剂等。,14.6.3 在生命科学中的应用,14.6.4 在医药研究中的应用,
