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1、第六章 亚病毒感染因子 Subviral agents,非细胞生物,朊病毒：只含蛋白质一种组分 prion,亚病毒:Subvirus,至少有核酸和蛋白质两种组分,类病毒：只含具有单独侵染性的RNA组分 viroid,卫星病毒、卫星RNA：天生缺陷病毒,satellite virus 包括卫星RNA,真病毒:Euvirus,疯牛病(Mad Cow disease),一、类病毒viroid,1922年发现，减产20%-70%潜伏期长，提纯和电镜观察无病毒粒子瑞士学者年发现马铃薯纺锤形块茎病的病原是一种只有侵染性小分子RNA而无蛋白质的感染因子，称为类病毒(viroid)PSTV。,类病毒经带毒叶片
2、、种子以及媒介昆虫传播，可引起马铃薯、西红柿、苹果、柑桔、椰子等多种经济植物严重病害,Potato spindle tuber disease,PSTD,T.O.Diener几项研究试验(1967-1971,用番茄研究),1、超离心：2、有机溶剂处理：3、酚处理：4、核酸酶处理：5、密度梯度离心：,105 000g 仅10%在沉淀中,(去脂肪)沉降系数不变,RNase处理，丧失活性,(蛋白变性）侵染活性更高,PSTV沉降系数710S,定 义,类病毒是一个裸露的闭合环状RNA分子，它能感染寄主细胞并在其中进行自我复制使寄主产生病症。类病毒的分子量小，仅为最小RNA病毒的十分之一，约10万Da,类
3、病毒是共价闭合的单链环状RNA分子，大小为246-399个核苷酸。所有的类病毒RNA没有mRNA活性，不编码任何蛋白,马铃薯纺锤形块茎病类病毒,Potato spindle tuber viroid(PSTV)提纯后的PSTV在电镜下观察(脲展层)：长50nm的棒状dsRNA分子，由2个互补的半体组成，一个含179个核苷酸，另一个含180个核苷酸，两者间有70%的碱基以氢键方式结合，形成122个碱基对，整个棒状结构中有27个内环，最大的螺旋含8个碱基对，最大的内环含有12个核苷酸。,PSTV的结构,类病毒的分类,目前ICTV公布的类病毒有27种，分为2个科、7个属：1、马铃薯纺锤形块茎类病毒科
4、 5属2、鳄梨白斑类病毒科 2属,类病毒病诊断和鉴定,Kochs postulates1、在病体中找不到细胞和体细胞的致病因子，可机械摩擦或昆虫媒介传染2、检测小分子核酸5S7S,区别于植物的RNA PAGE 浓度5%、10%、20%(一般病毒2%）3、接种 电泳带酚抽提液接种敏感寄主4、提纯,生产实际诊断的几种方法,1、指示植物2、凝胶电泳（应用广，但手续复杂）3、互补DNA（精确，适用）分子杂交，有已知类病毒RNA,类病毒的提纯,酚相（去掉）样品 上清（去掉）酚相（去掉）水相 沉淀 离心 水相 离心,上清 沉淀,上清(去)沉淀(类病毒),(RNA),乙醇,(各种RNA),DNaseSDS
5、酚,LiCl,大分子RNA,buffer酚、SDS,冷乙醇,破坏寄主DNA去酶蛋白,类病毒致病性机理,类病毒RNA分子直接干扰寄主细胞的核酸代谢类病毒也能结合到前mRNA的识别位点上，干扰mRNA的加工类病毒的+RNA 和-RNA还能作为寄主基因组DNA模板的竞争者，与依赖于DNA的RNA聚合酶结合，使之指导类病毒的复制，破坏了mRNA的合成。,类病毒复制,类病毒的遗传信息不足以编码任何复制酶健康植物中含两种类型的RNA合成系统：1、依赖于DNA的RNA聚合酶、和2、依赖于RNA的RNA聚合酶类病毒RNA在分子内的高度碱基配对和G:C含量，使其非常象DNA分子，寄主的依赖于DNA的RNA聚合酶
6、可能以其作模板合成类病毒的RNA,类病毒复制的滚环理论：,+RNA-RNA寡聚物+RNA寡聚物,裂解成+RNA单位长度的线状分子,共价闭合环状分子,类病毒前体,末端修饰,环状类病毒进入宿主细胞后：首先以(+)链类病毒为模板转录生成多个单位长度的(-)链复制中间体，其(-)链复制中间体有两种可能的命运：先被切割，再环化：(-)链复制中间体先被切割生成单位长度的线状(-)链分子，再自我环化，然后以环化(-)链为模板转录出多个单位长度的(+)链复制中间体，再进一步修饰和连接，形成具有感染性的单体环化的类病毒分子；先转录，再被切割修饰：多个单位长度的(-)链复制中间体直接转录生成(+)链复制中间体的模
7、板，然后剪接修饰。鳄梨白斑类病毒ASBVd(+)链和(-)链复制中间体中均发现有锤头样核酶结构，因此推测ASBVd可能是采取第一种复制途径，而PSTVd可能是利用第二种复制途径。,类病毒复制的滚环理论,类病毒的起源,推测、设想：1、原始生命形态非生命类病毒病毒原始细胞2、起源于寄主核酸存在于细胞核，与寄主核酸同源性高3、起源于病毒核酸缺失编码外壳蛋白的基因，RNA噬菌体核酸复制,类病毒病的防治,1、综合防治 避病、防侵染、培育无病种苗、防治传播介体2、抗病品种3、药剂：微量元素ZnSO4、H3BO3、CuSO4 等4、弱毒株保护,二、朊病毒prion,美国动物病毒学家Prusiner1982年
8、研究羊的瘙痒病(Scrapie)病原（核酸酶、蛋白酶、紫外线和其它化学因子处理）时发现的一种对人有侵染性的蛋白质颗粒，称为“Prion”(Protein infection的缩写)或“Virion”，译为“朊病毒”，或“毒朊”。Prusiner1997年因此获诺贝尔生理和医学奖2004年Prusiner证明,将提纯的朊病毒注射到基因工程小鼠的脑中时，可以引起脑病，该项研究发表于2004年7月30日Science。,二、朊病毒prion,人和哺乳动物朊病毒病的潜伏期特别长一般为数月乃至数10年时间，病程进行缓慢，由朊病毒感染中枢神经系统所产生的病理学特点为：神经原、神经轴索、星状细胞、树枝细胞呈
9、进行性空泡化 神经胶质增生；细胞外淀粉样变性蛋白沉积，形成光镜下可见的病理学特征 如羊搔痒病呈现羊搔痒病相关纤丝(scrapic-associated fibril，SAF)CJD则表现为淀粉样蛋白斑(amyloid plaque)，其实质均为传染性朊病毒蛋白的团块。,朊病毒在电镜下呈杆状颗粒，直径25nm，长100-200nm(一般为125-150nm)，杆状颗粒不单独存在，总是呈丛状排列，其大小和形状不一，有的丛含有多达100个杆状颗粒。,朊病毒蛋白(PrP)是由一种分子量为33-35kD的正常细胞蛋白prpc发生构型转变形成的，由于它类似于羊搔痒因子，故又称为prpsc。,朊病毒蛋白(p
10、rion protein,PrP),prpsc是prpc 的异构体，2者的一级结构和分子量大小完全相同。prpsc在蛋白酶解作用下切去N端序列，可生成prpsc 27-30kD。prpsc 27-30kD是一种蛋白酶抗性蛋白(proteinase-resistant protein)，该蛋白能够聚合成电镜下可见的棒状淀粉样蛋白。正常的prpc与prpsc之间在构型上的差异主要表现为螺旋含量减少，折叠的含量增加。,朊病毒蛋白(Prion protein,PrP),朊病毒蛋白(Prion protein,PrP),侵染性的朊病毒的单体含有3个或少于3个prp 分子，而杆丛聚合体可能含多到105个p
11、rp分子，其半感染剂量(ID50)介于10-100个杆状体。朊病毒的分子量为27-30 kDa。提纯的朊病毒用刚果红染色，在光学显微镜下可看到许多无定形结构，大小为1-20m。Prp具两种形式prpc 和prpsc。来源于同一个基因，宿主染色体基因编码，人的prp基因定位于20号染色体的短臂上。,朊病毒蛋白(Prion protein,PrP),prpc是一种细胞膜结合的糖蛋白，但通过膜内陷可进入细胞内，通常位于细胞内的prpc是可溶性蛋白。在神经系统中的可能作用：参与神经系统功能的维持 通过抗氧化途径而保护神经系统细胞免受氧化损伤，PrPc通过与铜原子形成复合物而发挥抗氧化活性参与淋巴细胞的
12、信号转导 参与核酸代谢 PrPC可能具有调整程序细胞死亡的功能,PrPc的生理功能,PrP2730是羊搔痒症致病因子证据,1、核酸酶、蛋白酶、紫外线和其它化学 因子处理2、用生化方法与搔痒因子共纯化，其浓 度与传染力在正相关3、PrP2730的分解动力学与传染性相同4、亲和层析纯化的PrP2730具有传染性5、用中和抗体中和PrP2730其传染性消失,-,+,溶于非变性洗涤剂,+,-,与特异的抗体反应,不释放,可从膜释放,依赖GPI（糖基磷酸肌醇）附着细胞膜,-(部分耐受),+,蛋白酶消化,prpsc,prpc,性 状,Prp 构型变化导致蛋白质性质变化,prp功能：学习和长期记忆的保持所必须
13、 CJD、GSS痴呆这些功能的丧失,朊病毒蛋白的传染过程,少量PrPSc与细胞PrPc结合后，以PrPSc为模板，使PrPc发生明显的构象改变而转变为PrPSc；PrPSc传染扩增，最后使PrPc全部转变成不溶性的PrPSc；脑组织形成淀粉样斑块直至死亡；PrPc转变成PrPSc后造成PrPc缺失，使得：神经细胞SOD酶活性下降，从而对超氧化物等所造 成的氧化损伤的敏感性增加神经细胞对高谷氨酸和高铜毒性的敏感性增加，综合导致神经细胞死亡变性,PrP c分子（圆圈左侧）与PrPSc分子（圆圈右侧）相互作用，并转化为后者的循环过程。PrPSc分子通过形成长纤维（右）的方式破坏正常的脑组织（左）。,
14、2005/4/22cell,传染过程,PrPc,PrPsc,朊病毒蛋白质的构象转变假说,1、“种子”模型 2、重折叠模式,1、“种子”模型 prpsc 充当“种子”,prpc单体构象比prpsc更稳定在没有“种子”存在时，固有的PrPC和极少量PrPsc单体之间发生快速的可逆性构象变化。当条件适宜时，PrPsc分子之间可互补缔合而变得稳定。从而使平衡式向PrPsc方向反应，直至形成一稳定的“种子”。这个“种子”可通过互相粘着而继续生长，最后碎裂成小的感染单位。此模式能解释经脑内潜育后才发病的朊病毒疾病。已有科学实验支持。,2、重折叠模式 模板介导的转换过程依靠催化PrPc或一个不稳定的中间体的
15、重排来提高转换，以形成更稳定的PrPsc构象。能解释由于点突变而引起的遗传性朊病毒病。点突变的发生增加了不稳定的中间分子的数量，同时加快它转换成PrPsc的速率。但此模型还无科学实验支持。,朊病毒研究进展,科学家首次观察到朊病毒入侵脑细胞的活动 将标记后的prpsc加入到培养的神经细胞中观察并用共焦显微镜照相利用激光来扫描荧光样品，并获得清晰的三维图像。绘制1000多张不同的图像并将获得的照片作成录像，显示出了prpsc进入细胞、沿着窄小的神经突前进并最终进入最接近的邻居细胞的过程 2005/5/25 Journal of Neuroscience 朊病毒传染性与蛋白分子大小有关：prpc以单
16、分子状态存在，对机体没有任何危害。但变异prpsc会多个分子聚集在一起（14至28个蛋白分子），然后扭曲变形。变异的朊病毒颗粒，会吸引单分子状态存在的prpc并将其“同化”，最终使动物脑组织海绵化，产生许多孔洞。,（2005/9/8 Nature）,朊病毒研究进展,淋巴结是传播朊病毒的关键 淋巴结是传播少量朊病毒到神经系统的关键所在；不能排除：淋巴结和朊病毒在身体内向其它非神经组织传播有关。2007/9/25 BMC Veterinary Research致死型朊病毒传播中的关键蛋白被发现 有一种蛋白可能是朊病毒中关键蛋白，裂解感染性蛋白生成“种子”片段，然后侵袭脑组织致宿主迅速死亡。传播过程
17、中还存在另一关键步骤朊病毒复合物的裂解片段的存在。朊病毒复制需要有热休克蛋白(Hsp104)参与，可能具有这种蛋白“粉碎机”的功能。（2007 PLoS Biology）,朊病毒研究进展,找到疯牛病致病新病毒 欧洲分子生物学组织杂志 2007，10除了已知的被称为PrP的朊病毒蛋白外，新发现了另一种被称为沙杜（Shadoo）的朊病毒蛋白。“像疯牛病这样的朊病毒疾病，我们在许多方面都尚未搞清。比如正常的朊病毒蛋白有哪些功能，朊病毒如何在动物之间进行传播，以及如何导致脑细胞死亡等。希望新的沙杜朊病毒的发现，会在这些重要问题上给我们新的启迪。”,朊病毒研究展望,已经从结构水平上认识朊病毒：PrPC的
18、结构、折叠动力学和可能转变成PrPsc的折叠途径。蛋白酶消化敏感性实验和脑组织杂交分析证明PrPsc可采取不同的构象。已经知道朊病毒有不同的株型且相互杂交。朊病毒传播和致病的必需区域已被限定为两个不同片段，共同区域只包含106个残基。随着X-射线衍射技术、核磁共振光谱等技术应用，朊病毒结构的研究即将取得成功，其功能学的研究已成为科研的工作重点。,疯牛病(Mad cow disease),疯牛病(Mad cow disease)牛海绵状脑病 BSE(Bovine Spongiform Encephalopathy)一、来源与分布1985年英国农场牛群比利时、法国、德国、意大利、加拿大、日本等二、
19、易感动物：小白鼠、羊、猪、猫、羚羊、金丝猴、猕猴等，但不感染仓鼠三、传播途径：垂直传播、被污染的饲料经口腔传染。常见的传染源：骨、肌肉、肉骨粉、脏器、淋巴结、唾液、血液等,四、病原1986分离到“痒病相关原纤维”(Scrapie-associated Fibrils,SAF)，经氨基酸分析确认与“锯形蛋白Prp-Scrapie,PrPsc”有98%同源性1987，用BSE患牛脑组织匀浆接种小白鼠，症状相似分布于中枢神经系统，其次存在于脾、淋巴结，肠、唾液腺中浓度高，肌肉和血液中较低，粪便、尿液中很少对高强度理化灭活处理有很强抵抗力，经核辐射仍可存活，普通烹调温度、消毒、冷冻和干燥均无灭活作用，
20、对强酸强碱抵抗力强，对福尔马林、紫外线不敏感，121耐30min，用2-5%次氯酸钠处理24h才灭活,疯牛病(Mad Cow Disease),疯牛病(Mad cow disease)五、临床症状1、行为变化：恐惧、神经质、狂暴、具攻击性2、姿势和运动异常：后躯运动失调、站立困难、头部和肩部肌肉震颤抽搐、倒地不起3、感觉变化：对声音、气味和触摸过敏离群、不安、体温偏高、体质下降、产奶量减少、呼吸频率高、震颤、倒地不起、死亡 发病几个星期12个月 潜伏期28年（4-5）牛：22个月17岁（3-5年）,疯牛病(Mad cow disease)六、病理变化1、脑灰质呈空泡变性2、神经元消失3、原胶质
21、细胞肥大七、英国疯牛病风波1985年首次发现，1996/3/20（新型克-雅氏病）直接经济损失450亿美元，补偿农民120-180亿，社会问题（牛只存栏数1180万头，从业20万人，总产值60亿美元）、对英国政治、外交等影响大八、我国检疫政策牛只存栏数1.5亿头，年产牛肉600多万吨，牛奶700多万吨 如扑杀 1500亿元直接损失,朊病毒消毒方法和朊病毒病的防治,病原因子136高压蒸汽消毒1h 12mol/L NaOH 处理1h以上5 mol/L以上的NaClO溶液消毒2h960ml/L的乙酸溶液浸泡1h以上（固定组织的甲醛100ml/L对病料消毒不彻底）焚烧病畜及产品培养抗病家畜 蛋白质构象
22、变化的机理,人的朊病毒病可分为传染型、遗传型和散发型三种形式传染型朊病毒在人群中水平传播Kuru病:主要局限于巴布亚新几内亚的Fore族人群，传播途径与食人肉习俗有关,症状与羊搔痒病相似医原性CJD:通过接受CJD患者捐献的器官或静脉注射污染有朊病毒的人生长激素传播遗传型家族性CJD、FFI和GSS，由生殖细胞突变形成散发型大多数CJD和部分GSS，其致病机制可能与体细胞突变或PrP的自发性构型改变有关除此之外，在英国和法国还发现一种变异型CJD，可能是由牛朊病毒传染给人所引起的,人类朊病毒病,人类朊病毒病1、库鲁病（kuru)/震颤病2、克雅氏病（CJD)3、格斯综合症（GSS)4、新型克雅
23、氏病（vCJD)5、传染性病毒痴呆病（早老性痴呆病）(Presenile Dementia)6、致死性家族失眠病(Fatal Familial Insomnia,FFI),库鲁病（kuru),亚急性传染性海绵状脑病小脑共济失调、震颤丧失运动能力，伴有构音障碍，患者100%死亡。潜伏期430年新几内亚东高原Fore人陋习吃尸脑流行区有3万多人/1000英里2发病成年女:男5:1 男:女 23:1高原温度（水沸点）95,克雅氏病（CJD),全球分布，我国有发生(潜伏期可长达30年)感冒样症状精神异常，痴呆、小脑共济失调、昏迷伴有肺部感染死亡病程：数月1年（平均5个月）散发型90%、遗传型10%医源
24、型少：污染的医疗器械、组织移植、注射脑垂体源激素（生长素、促性腺素等）100%死亡,新型克雅氏病（vCJD)207例CJD中10人有明显不同临床：忧虑、抑郁、进行性神经异常小脑 综合症，健忘、痴呆肌阵挛或舞蹈病 无CJD脑电图异常 病理：海绵状脑与BSE的关系：,用于诊断朊病毒病的技术,CJD-human,Kuru-human,BSE-(cow),Scrapie-(sheep),三、卫星病毒satellites,在植物病毒中，有些病毒含有两种相关的病毒颗粒:一种是较大的病毒颗粒，另一种是较小的病毒颗粒 这两种病毒颗粒之间的抗原性完全不同;它们的RNA核苷酸序列也无同源性;小病毒颗粒RNA的侵染
25、与复制必需依赖于大病 毒颗粒 将这种小病毒颗粒称为卫星病毒，大病毒颗粒称为辅助病毒helper virus。Satellite Tobacco necrosis virus(STNV)16.8nm/28nm,三、卫星病毒satellites,丁型肝炎病毒HDVHBV,比较不同卫星病毒，发现它们都有下列性质：单独没有侵染性，必需依赖辅助病毒才能侵染和复制（基因组有缺陷）非辅助病毒复制所必需，可抑制辅助病毒的复制卫星病毒的RNA能够编码自身的外壳蛋白，其外壳蛋白与辅助病毒没有血清学关系卫星病毒RNA与辅助病毒基因组RNA核苷酸序列无同源性,四、卫星核酸,1976年美Kaper等在CMV中首先发现:
26、卫星RNA是伴随病毒复制的低分子量（300 400b)线状小RNA，不能独立复制,完全依赖于特定辅助病毒,它与病毒RNA无序列同源性。CMV的卫星RNA：335个核苷酸组成，复制依赖于辅助病毒，但又干扰辅助病毒RNA的复制，降低病毒的致病能力，并改变寄主植物的症状表现。既是侵染病毒的RNA，又是亚病毒之一。卫星RNA能作为黄瓜花叶病毒病的生防因子,ICTV已将卫星核酸分为：单链卫星DNA：番茄卷叶病毒卫星DNA双链卫星RNA：啤酒酵母M病毒卫星RNA单链卫星RNA：CMV卫星RNA等,我国卫星核酸的研究：中科院微生物所田波研究员，1981年从应用角度，将其作为生防因子，研究中发现卫星RNA完全
27、符合Kochs法则，侵染特异的寄主（病毒），且能维持自身的遗传特性。提出卫星RNA属于亚病毒,病毒卫星RNA致弱病毒机理,一、抑制病毒及其基因组复制CMV为三分体RNA基因组病毒，含：RNA-1（3900b）RNA-2（3400b）侵染性所必须RNA-3（2193b）另含有亚基因组RNA-4(1027b)，其卫星RNA称RNA-5（335b）研究单独卫星RNA对病毒复制的影响（1）去除卫星RNA的CMV（电泳洗脱,多次单斑分离，纯化）（2）表达卫星RNA的转基因植株,卫星RNA 弱CMV 强CMV A492(单抗ELISA检测)+0.240.27(31.5%)-+0.380.42(49.4%)
28、-+0.770.85转卫星基因和未转化（对照）的烟草和番茄幼苗接种不含卫星RNA的CMV后(用病汁液定量接种藜)：表达卫星RNA的斑点数只相当于对照的8.5%23.7%,卫星RNA对CMV复制的影响,烟草分别接种含卫星RNA的CMV不含卫星RNA的CMV用3H尿嘧啶核苷酸标记 提取总RNA后 PAGE分离，分别测定RNA量，结果：接种含卫星RNA的CMV处理卫星RNA含量高接种不含卫星RNA的CMV处理病毒RNA含量稳定卫星RNA大量积累，而病毒基因组RNA复制受抑卫星RNA对病毒基因组RNA的体外复制有抑制作用,测定卫星RNA量与病毒RNA量,二、抑制外壳蛋白进入叶绿体病毒致病机理：1、病毒
29、外壳蛋白(CP)的致病作用2、CMV-CP可进入完整的离体叶绿体3、CMV-CP抑制离体叶绿体光系统 卫星RNA干扰CMV-CP、番茄不孕病毒(TAV)CP进入叶绿体,卫星RNA对其它病原物的生物学效应,1、卫星RNA抑制类病毒 卫星RNA直接作用于PSTVd复制过程2、卫星RNA致弱的CMV诱导植物产生对 真菌病害的抗性 黄瓜霜霉病 为对照发病率20%30%卫星dsRNA诊断：温度梯度（3070）电泳核苷酸序列有12个核苷的突变也可在变性图谱和转变温度上反应出来,DI颗粒、卫星病毒、卫星RNA、类病毒性质的比较,a:因缺失部位而有所不同，脊髓灰质炎病毒DI RNA能复制但不被壳体化b:STMV基因组的3端与辅助病毒有序列和结构的相似性c:某些嵌合的卫星RNA与其辅助病毒基因组有广泛的3序列同源性,亚病毒研究提供的启发,1、传染病病原物的种类远未穷尽2、类病毒和朊病毒病害防治研究和实践证明，病毒的基因组愈小愈简单，它所引起的病害的防治越困难(对紫外线（260nm）的抵抗力比一般病毒高500040000倍）3、可复制的致病基因组大小的下限也未穷尽4、生物大分子无疑是分子生物学研究的主要对象，但生物小分子也不容忽视,本章要点,1、亚病毒的类型，各有何特点？2、了解朊病毒的研究进展，常见的朊病毒病。3、研究亚病毒的意义4、有关名词,
