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1、实验二 氨茶碱加样回收率,方法学考察,目的：证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求。,准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。,验证内容,一、准确度（accuracy）准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。,原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。,制剂可用含己知量被测物的各组分混合物进行测定，即采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定。,中药分析的准确度一般用加样回收试验衡量。中药回
2、收率一般要求在95105%范围内，有些方法操作步骤繁多时，可要求在90110%范围内，RSD一般在3%以内。,测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。,回收试验 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。,加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。,数据要求 规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数）表示。,偏差（d）：测量值与平均值之差,标准（偏）差（SD或S）,相对标准（偏）差（RSD），也称变
3、异系数（CV）,紫外可见分光光度计主要结构及功能,紫外分光光度计主要由光源、单色器、样品池（吸收池）、检测器及放大器和记录显示系统所组成。,1、光源,钨灯丝和氢灯两种钨灯丝适宜使用的范围是360nm-1000nm；氢灯或氘灯适宜使用的范围是150nm-360nm。因为玻璃会吸收紫外光，灯泡必须用石英材料。,单色器是指能将来自光源的复色光按波长长短顺序色散为单色光，并能任意调节波长的装置。常由棱镜和光栅组成。经棱镜或光栅色散成一系列由单色光带组成的光谱，逐个从单色器的出口狭缝射出。,棱镜由玻璃或石英制成，玻璃色散能力大，但可吸收紫外光，只能用于350-820nm的波长测定。样品池和参比池需要配对
4、（即完全相同的两个），其厚度（光束通过溶液的路径长度）一般为1mm、2mm、5mm、1cm、2cm、4cm。如在定量测定时，所使用的一组样品池要完全一致。,2、单色器（分光系统）,3、样品池（参比池）,检测器是一种光电转换设备，它将光强度转变为电信号显示出来。5.测量系统 包括放大器和结果显示装置。在主机中装有微机处理器，将测量数据显示在屏幕上。,4.检测器,T6型紫外可见分光光度计结构,操作流程,一、开机自检,初始化 43%1.样品池电池 OK2.滤光片 OK3.光源电机 OK,打开仪器主机电源，开始初始化，3分钟左右初始化完成。,初始化完成后，仪器进入主菜单界面。,光度测量功能扩展系统应用
5、,二、进入光度测量状态,在上图所示状态按ENTER键，进入光度测量界面,光度测量 0.000 Abs 250 nm,三、进入测量界面,按START/STOP键，进入样品测定界面,250.0nm-0.002 Abs No.Abs Conc,四、设置测量波长,按GOTO键，在下图界面输入测量的波长，例如需要在275nm测量，输入275，按ENTER键确认，仪器将自动调整波长。,请输入波长:,275.0nm-0.002Abs No.Abs Conc,调整波长完成后如下图,五、进入设置参数,在这个步骤中主要设置样品池。按ENTER键进入参数设定界面，按键使光标移动到“试样设定”，如图所示。按ENTER
6、键确认，进入设定界面。,测光方式数学计算试样设定,六、设定使用样品池个数,在这个步骤中主要设置样品池。按键使光标移动到“使用样池数”，如图所示。按ENTER键循环选择需要使用的样品池个数。,试样室：八联池样池数：2空白溶液校正：否样池空白校正：否,七、样品测量,按RETURN键返回到参数设定界面，再按RETURN键返回到光度测量界面。在1号样品池内放入空白溶液，2号样品池内放入待测溶液。关闭好样品池盖后按ZERO键进行空白校正，再按STRT/STOP键进行样品测量。测量结果如下图所示：,275.0nm-0.002Abs No.Abs Conc 1-1 0.012 1.000 2-1 0.052
7、 2.000,八、结束测量,测量完成后按PRING键打印数据，如果没有打印机请记录数据。退出程序或关闭仪器后测量数据将消失。确保从样品池中取出所有比色皿，清洗干净以便下次使用。按RETURN键直到返回到仪器主菜单界面后再关闭仪器电源。,实验目的,了解药物在含量测定前进行加样回收率试 验的目的；掌握加样回收率试验具体方法；学习加样回收率计算方法。掌握紫外分光光度计操作方法。,实验原理,任何药物在进行含量检测以前，都要对该检测方法的准确度、精密度及仪器灵敏度等进行考察，目的是证明采用的方法是否适合于相应的检测要求。其中准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。
8、加样回收率试验最终反映的是测试结果的准确度。在测定样品时，于已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。,实验仪器与材料,实验仪器：紫外分光光度计、精密天平、石英比色皿、50ml烧杯、玻璃棒、称量纸、10ml容量瓶、25ml容量瓶、洗瓶。实验材料：氨茶碱原料、蒸馏水、氢氧化钠。0.01M NaOH溶液的配制：称取氢氧化钠0.4g，用蒸馏水定容至1000ml，即得。,实验方法,步骤一：标准品溶液的制备：精密称取氨茶碱标准品12.5mg置于25mL容量瓶中，先用少量0.01M的NaOH溶液振摇使溶解，再用
9、该溶液定容至刻度，配成浓度为0.5mg/mL的标准储备液；步骤二：再从标准储备液中吸取1ml，置于10mL容量瓶中，用0.01M的NaOH溶液定容至刻度，摇匀，配成浓度为0.05mg/mL的溶液，记为标准储备液，备用。步骤三：样品溶液的制备：从标准储备液中吸取200l，置于10ml容量瓶中，用0.01M NaOH溶液定容至刻度，摇匀，即得氨茶碱样品溶液，平行制备9份，再导入9个试管中，并相应做好标记；,步骤四：从9个试管中分别取出5ml放置于10ml容量瓶中，做好相应标记后，备用；步骤五：9个试管中剩余部分用于含量检测（采用紫外分光光度法在275nm处测定吸光度值（A275），根据已知标准曲线求出溶液中氨茶碱浓度，并记录）。步骤六：再从标准储备液中分别取出0.8ml（80%）、1.0ml（100%）和1.2ml（120%）溶液各三份，加入步骤四的容量瓶中，用0.01M的NaOH溶液定容至刻度，摇匀并做好标记，然后采用紫外分光光度法在275nm处测定吸光度值（A275），计算加样回收率及相应的RSD值。,实验结果,1.加样回收率（%）计算公式：加样回收率=（加样后测定值-原样测定值）/加样量100%2.RSD（%）：求三个浓度点之间RSD值即可。3.已知标准曲线方程：y=0.0597x+0.0146,
