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1、超氧化物歧化酶(SOD)的生产,第六组 钱龙,SOD知识简介,1.SOD的概念 超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶，是生物体内抗氧化酶系中主要成员之一。,2.SOD的分类 按其结合的金属离子可分为Fe-SOD、Mn-SOD、CuZn-SOD三种,SOD知识简介,3.SOD的理化性质 3.1 SOD对氰化物和H2O2的敏感性 长时间用过氧化氢处理可使 CuZn-SOD 和 Fe-SOD失活，而Mn-SOD不受影响,3.2 SOD的吸收光谱特性 CuZn-SOD具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和酪氨酸的含量较低，它在280 nm处并没有最大吸收峰。CuZn-SOD的可见光
2、最大吸收波长都在680 nm左右，这反映了酶分子中Cu2+的光学特性。,SOD知识简介,3.3 SOD稳定性及影响因素,3.3.1 PH、热、蛋白酶的影响：SOD在pH5.39.6间催化性能良好，在pH4.5pH11间能稳定存在。pH3.6时，CuZn-SOD中95%的Zn要脱落，在pH12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变而使酶失活。,3.3.2 SOD对热的稳定性与溶液中离子强度有关。当离子强度很低时,即使加热到95,其活性损失也很少其他因素：SOD活性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中性、无乙醇饮料中SOD活性较稳定。另外还发现有机溶剂和Cl对SO
3、D的活性具抑制作用,SOD的作用,welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experience,它催化超氧阴离子转化为H2O2和O2的反应，即催化超氧阴离子自由基O2-发生歧化反应，从而清除O2-，2O2-+2H+H2O2+O2，在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用，在免疫系统中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，防衰老。,实训目的,（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。,2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。,3）掌握离心机的使用。,实训原理,
4、welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experience,邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出 O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留3045s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。,实训器材,welcome to use these PowerPoint templates,New C
5、ontent design,10 years experience,大蒜，冷丙酮，磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)氯仿-乙醇混合液 邻苯三酚 浓盐酸仪器：天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管（8）、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶（8个）、玻璃棒（8根）、试剂瓶250mL（3个）、500mL（3个）、250mL烧杯（16个）、试管带胶塞(80根)、移液管(5根),SOD的生产,1.SOD酶的提取 称取5克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞后，加入pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH7.8）15ml，继续研磨20min,使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后60
6、00r/min冰冻离心15min，放弃沉淀，取上清液。,2.去除杂蛋白 上清液中加入0.25倍体积的氯仿乙醇混合液搅拌15min,6000r/min离心15min，放弃沉淀，得到的上清液即是粗酶液,SOD的生产,3.SOD酶的沉淀分离 粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓度60%，持续搅拌15min，6000r/min离心15min，得到SOD酶沉淀,4.将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液5mL中，然后6000r/min离心15min，放弃沉淀，取上清液，用凝胶sephacylS-200进行纯化，然后超滤浓缩。,SOD的生产,5.用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量,6.将
7、浓缩冷冻干燥后即得成品。,连苯三酚自氧化速率的测定,取4.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,加入10 连苯三酚液，迅速摇匀 空白：取4.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,加入10 缓冲液，迅速摇匀,倒入光径1cm的比色杯中，在325nm波长下于恒温池中每隔30s测A值一次 计算线形范围内，每1minA的增值，此即连苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.07OD/min,酶活测定,测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同,取1.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,加入3ml酶液，加入10 连苯三酚液，迅速摇匀,空白：取1.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,加入3ml
8、酶液，加入10 缓冲液，迅速摇匀,计算加酶后连苯三酚自氧化速率,SOD的生产,结果计算,酶活力单位 提取液酶活力单位：=2（OD1-OD2）5/0.1=粗酶液活力单位：=2（OD1-OD2）5/0.1=酶液活力单位：=2（OD1-OD2）5/0.1=总活力 提取液总活力U=活力单位总体积=粗酶液总活力=活力单位总体积=酶液总活力=活力单位总体积=比活力 提取液酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=粗酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=,注意事项,welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experience,大量试验和临床应用表明，无论何种给药方式，除罕见的超敏反应外，SOD对人体无毒性。虽然SOD是Mr在30 000以上的蛋白质，但却未发现具有抗原性，其原因也正在进一步研究中。,2.SOD生产时的注意事项,2.1 在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底,2.2 PH的控制力度很重要，以及在实验中的温度等,2.3 要学会正确使用分光光度计,
