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1、非法酵革兰阴性杆菌特征及鉴定思路,张秀珍,内容,非发酵细菌分类主要非发酵细菌特征非发酵细菌耐药特征临床最常分离非发酵细菌鉴定,非法酵革兰阴性杆菌感染特点,引起临床各科室 人体各部位感染鉴定比肠杆菌科复杂耐药谱广 临床治疗困难,非发酵菌的分类和生物学特性,不发酵葡萄糖有氧方式代谢,包括不同的科、属、种,缺乏糖酵解酶类,代谢必须在有氧环境中进行,非发酵菌,Nonfermentative Bacilli,不是细菌分类的正式名称,是对一大群细菌的统称,非发酵菌的分类和命名,与肠杆菌科不同，非发酵菌不能简单地归于具有明显特征的某一菌科，且很多非发酵菌的正确分类问题仍未解决 主要的非发酵菌分为6个科 1
2、分类不明其余不属于以上菌科的非发酵菌暂时归类于分类学尚未明确的细菌,非发酵细菌原分类:,假单孢菌科 奈瑟菌科 未分科,非发酵细菌现代分类,假单孢菌科 产碱杆菌科 甲基球菌科 根瘤菌科 黄杆菌科 莫拉菌科 未定,临床常见非发酵菌的分类,与鉴定方法相关的分组,第一组 有动力,极鞭毛:假单胞菌科 rRNA群IV,第二组 有动力,周鞭毛:产碱杆菌科 产碱杆菌属 第三组 无动力,OXI(+):黄杆菌科 黄杆菌属 华丽杆菌属 稳杆菌属第四组 无动力,OXI（-）不动杆菌属,非发酵菌的分类,假单胞菌科,rRNA I群,rRNA III群,rRNA V群,rRNA IV群,rRNA II群,假单胞菌属,伯克菌
3、属,丛毛单胞菌属,短波单胞菌属,寡养（窄食）单胞菌属,有动力 极鞭毛,第一组,假单孢菌科根据rRNA-DNA同源性研究分为5组,rRNA-I:假单孢菌属 铜绿 荧光 恶臭 门多萨 产碱 斯氏 类产碱,假单胞菌属生物学特性,G-杆菌 直或微弯,一根或多根极鞭毛,氧化利用葡萄糖,氧化酶阳性,rRNA II,伯克菌属:类鼻疽;葱头;唐菖蒲;皮氏;,伯克菌属生物学特性,所有rRNAII群的细菌归入一个新的菌属伯克菌属包括13个种 其中假鼻疽伯克菌葱头、唐昌蒲、皮氏伯克菌均以前称为假单胞菌,伯克菌属生物学特性,葱头伯克菌,G-杆菌,多根极鞭毛,氧化利用葡萄糖,氧化酶阳性 弱阳,伯克菌属生物学特性,葱头伯
4、克菌,黄色菌落,赖氨,生长无特殊要求,SXT 敏感 常用药物,氨基糖甙类 天然耐药,酸阳性,植物病原菌葱头腐烂和人类的坏疽,水源和潮湿表面,唐菖蒲伯克菌,伯克菌属生物学特性,黄色无荧光菌落,氧化酶阴性,不分解麦芽糖,ONPG 阳性,尿酶阳性,伯克菌属生物学特性,皮氏伯克菌,生长缓慢,3个生物型,12根鞭毛,针尖样菌落,伯克菌属生物学特性,类鼻疽伯克菌,人和动物类鼻疽病 生长有特定区域 存在于赤道南北纬20度之间的土壤和不流动的水中，主要泰国和越南。,大多数感染无症状，只能通过血清学诊断,刺激性泥土味,生长无特殊要求,rRNA III,丛毛菌科:丛毛单胞菌属食酸菌属,丛毛单胞菌科生物学特性,具有
5、特征性的长极丛鞭毛,食酸丛毛单胞菌最常分离,通过OF果糖 甘露醇 乙酰胺阳性 与其它菌相鉴别,唯一橘黄色吲哚反应,OF葡萄糖培养基上不产酸,丛毛单胞菌属生物学特性,丛毛单胞菌属,土生单胞菌 不是人类致病菌,食酸丛毛单胞菌 机会感染菌,唯一橘黄色吲哚反应,睾酮丛毛单胞菌属 极为少见,食酸菌属,食酸菌属生物学特性,敏捷食酸菌,中泛食酸菌,德氏食酸菌,氧化酶阳性,有动力,氧化利用糖类,临床意义不明,rRNA IV,短波单胞菌属缺陷短波单胞菌泡囊短波单胞菌,短波单胞菌属生物学特性,短波单胞菌属,氧化酶阳性,不分解糖 醇或反应很弱,短波 紧密螺旋单极鞭毛,生长缓慢 48h 可见菌落 深黄到橘黄色素 七液
6、苷阳性 区别于其他产碱假单胞菌,临床少见 体弱 免疫力低下患者感染 菌血症,rRNA V,寡养单胞菌属或窄食单胞菌属嗜麦芽寡氧单胞菌,嗜麦芽寡养单胞菌名称变化,寡养单胞菌属生物学特性,1961年嗜麦芽假单胞菌,1983年嗜麦芽黄单胞菌,1993年嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌,寡养(窄食)单胞菌属,寡养单胞菌属生物学特性,无溶血,呈淡绿色或浅绿色,有氨水味,血平板菌落粗糙,菌落特点,氧化酶阴性,葡萄糖氧化缓慢,麦芽糖快速氧化,赖氨酸 DNA 阳性,寡养单胞菌属生物学特性,生化反应,耐药特点,寡养单胞菌属生物学特性,天然耐药,泰能,SXT 敏感,氨基糖甙类,不定菌属的非发酵菌,金色单胞菌属,黄色单胞菌
7、属,（浅黄假单胞菌）,浅金黄单胞菌,栖稻黄色单胞菌,（栖稻黄色假单胞菌）,不定菌属的非发酵细菌,鞘氨醇,希瓦菌属,希瓦,16个种,深海,羽田,少动鞘氨醇菌,有意义,单胞菌属,鞘氨醇单胞菌:16个 少动鞘氨醇有意义希瓦菌:希瓦 深海,非发酵菌的分类,第二组,有动力 周鞭毛,土壤杆菌属,医学上唯一有意义的菌属,根瘤菌科,产碱杆菌科,产碱杆菌属,鲍特菌属,非发酵菌的分类,条件致病菌 院内感染,产碱杆菌属,木糖氧化产碱杆菌,木糖氧化亚种,脱硝亚种,粪产碱杆菌,皮氏产碱杆菌,非发酵菌的分类,产碱杆菌的主要生物学特性,产碱杆菌属生物学特性,产碱杆菌属,粪产碱杆菌,木糖氧化产碱杆菌,木糖氧化亚种,脱硝亚种,
8、皮氏产碱杆菌（1986年描 述）,产碱杆菌属生物学特性,粪产碱杆菌 临床标本中最常见,菌落细小 边缘不规则,在碳水化合物培养基上,强烈碱性反应,还原亚硝酸盐 不还原硝酸盐,黄杆菌科,黄杆菌属,金色杆菌属,稳杆菌属,威克菌属,伯杰菌属,非发酵菌的分类,第三组,无动力 氧化酶阳性,分类学不明,鞘氨醇菌属,寡源菌属,莫拉菌属,华丽杆菌属,最新分类,变动很大,金色杆菌属,粘黄杆菌,产吲哚黄杆菌,大比目鱼黄杆菌,脑膜败血黄杆菌,大菱鲆黄杆菌,黄杆菌科生物学特性,被重新分为短稳杆菌,归为新的属Myroides，,水生 约翰 食果胶嗜冷 嗜糖 琥珀黄杆菌,黄杆菌属,吲哚都是阴性,芳香黄杆菌,短黄杆菌,在人类
9、临床标本中尚未发现,黄杆菌科生物学特性,嗜醇鞘氨醇杆菌,黄杆菌科分类及生物学特性,临床标本中遇到的已有新的归属的种,脑膜败血金色杆菌,IIb黄杆菌（伯杰手册归入金粉黄杆菌）,短稳黄杆菌,多食鞘氨醇杆菌,第IV组 无动力 氧化酶阴性,不动杆菌属,不动杆菌的分类主要生物学特性,新一版伯杰手册 醋酸钙不动杆菌,开始被归于奈瑟菌科但最近又被归于莫拉菌科,DNA-DNA杂交 营养特征17个基因种,利用生化特征 生长试验可区分其中 16个基因种 7个基因种有菌名,不动杆菌的分类主要生物学特性,只有7个基因种有菌名：基因种1醋酸钙 基因种2 鲍曼基因种4溶血 基因种5 琼氏 基因种7 约翰逊 基因种8 洛菲
10、不动杆菌,其余基因种未命名,不动杆菌的分类主要生物学特性,生物学特性,血琼脂,菌落圆形 光滑 边缘整齐灰白色一般无色素 有的产生黄褐色色素,G-球杆菌 常成对排列 不易脱色常染成假阳性 拉丝试验容易成假阴性,有的种产生溶血,不动杆菌的主要生物学特性,氧化酶阴性 触酶反应不定吲哚 H2S 甲基红 VP反应均阴性不产生赖、鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶有的种能产生苯丙氨酸脱氨酶所有种不能还原硝酸盐大多数能利用枸橼酸盐无动力，硝酸盐还原阴性,非发酵菌的生物学特性,G-杆菌 球杆菌,氧化酶大多阳性 少数阴性,多数菌属有动力 少数无动力,极生 周生鞭毛 无鞭毛,OF糖大多氧化型 少数产碱或不利用,非发酵菌
11、的鉴定,临床标本中最常见 铜绿鲍曼不动 嗜麦芽窄食单胞菌,选择少数关键性试验便可容易鉴定快速为临床医生提供信息,简便法,非发酵菌的鉴定,分组法,非铜绿 鲍曼不动 嗜麦芽,必须增加其他试验进行种的鉴定,根据动力和氧化酶将各种临床上重要的非发酵菌分为四个部分,非法酵革兰阴性杆菌的共同特点,在中国兰或麦康开选择培养基上呈不发酵乳糖的菌落(中国兰上粉红色)氧化酶大多阳性有鞭毛或无鞭毛革兰阴性杆菌或球杆菌不能发酵糖色素,鉴定非发酵革兰阴性杆菌的基本步骤,初始菌落识别:在中国兰或麦康开培养基上呈不分解乳糖的菌落 氧化酶革兰染色色素确认非发酵细菌O/F 鞭毛染色选择鉴定系统API 20NE ATB VIEK
12、2Compact等,临床常见非发酵革兰阴性细菌的耐药特征,铜绿假单孢菌不动杆菌嗜麦芽窄食单孢菌,绿脓杆菌耐药机制,膜蛋白缺失使通透性下降高产ampC酶;产ESBL;产金属酶泵出机制,铜绿假单孢菌,铜绿假单胞菌的细胞外膜上没有大多数革兰阴性细菌所具有的典型的高渗透性孔蛋白，它的孔蛋白通道对小分子物质的渗透速度仅为典型孔蛋白通道的1%。,产KPC酶,国内：已在肠杆菌科的多个菌属中有报道。肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌、沙门菌属、弗劳地柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌等。该类酶除阴沟肠杆菌可有染色体介导外，其他各类细菌均可为质粒介导，已成为临床治疗难题,如何检测?,产KPC酶的菌株用常规
13、药敏试验不容易检出。CLSI关于碳青霉烯类的判断标准：厄他培南2g/ml 亚胺培南、美罗培南4g/ml 因此，MIC2g/ml 或4g/ml的菌株仍可判断为敏感的警惕：在常规药敏中如遇第三、第四代头孢菌素以及其他的-内酰胺类耐药的菌株均应该进行稀释法测定碳青霉烯类的对这些菌株的MIC。,检测KPC酶的最佳底物,厄他培南是检测KPC酶的最佳底物。建议1：可将该药列为常规药敏试验的品种建议2：对所有具有ESBLs/AmpC酶样表型（即对第三、第四代头孢菌素耐药）的肠杆菌科细菌采用纸片法或MIC法（E-试验）进行厄他培南（和其他碳青霉烯类）的测定。如MIC为2或4g/ml应视作有产KPC酶和其他碳青
14、酶霉烯酶的可能。这时应与临床医师联系，并将该菌株送往参考试验室作进一步的研究。,改良的Hodge 试验,0.5麦氏浊度单位大肠埃希菌 ATCC25922涂布MH平板中间贴亚胺培南（10g）纸片接种待检菌的无菌接种环自 纸片外缘向平板边缘划线35过夜培养结果判断：亚胺培南抑菌圈内出现待检菌矢状生长者为产碳青霉烯酶 菌株PCR 扩增试验、DNA测序证实为某种KPC酶,E coli ATCC25922,KPC+？,KPC-,KPC+？,不动杆菌的耐药机制,对多种窄谱内酰胺酶耐药由于TEM1和CARB型内酰胺酶对新型三代头孢菌素耐药是因为产大量染色体头孢菌素酶和超广谱的TEM酶,不动杆中最主要的碳青霉
15、烯酶是D类酶 OXA-23、24、25、26、27、40、49、51、54、55、58、60该酶能水解亚胺培南、青霉素，但不水解三代头孢菌素.,不动杆菌主要耐药机制,不动杆菌中还产IMP或VIM型金属酶，该酶水解底物范围广，包括碳青霉烯类、青霉素类和头孢菌素抗生素，不被克拉维酸等酶抑制剂抑制，但能被EDTA、2-巯基丙酸抑制,嗜麦芽窄食单胞菌,常感染严重衰弱和免疫力低下病人在医院水龙头、污水排水孔呼吸机湿化器均可分离到可引起菌血症、心内膜炎、医院获得性肺炎、尿路感染、皮肤、软组织静脉放置插管是引起菌血症的主要原因，死亡率达4169,嗜麦芽窄食单胞菌的耐药机制,细胞壁对抗生素的亲和力极差膜蛋白对
16、氨基糖甙渗透力低下药泵外排机制产二种内酰胺酶L1 内酰胺酶L2内酰胺酶（金属酶）（头孢菌素酶）,细菌定植的定义定植是个”相对”的概念 定植 感染,宿主因素,细菌本身因素,下呼吸道感染中,非发酵菌是临床棘手的问题,下呼吸道中,非发酵菌易定植内源性:细菌抵抗力强-医源性抗生素选择压力一旦演化为感染,病情重,死亡率高,MIC/药敏结果与临床治疗有矛盾分离株不一定是感染病原菌,预防比治疗更重要,在治疗每一患者前用含酒精的洗手液洗手;清洁可能污染的物体表面;特别注意机械通气接口的消毒。,New antibiotics in the world during the last 20 years,16,14,10,3,7,谢谢大家Thank you,
