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1、1,抗生素工业生产,第二部分,2,菌种优化,抗生素发酵及提取精制,工业生产方法及总的工艺,抗生素生产菌的菌种,菌种来源,抗生素工业生产,内 容 速 览,3,抗生素的工业生产方法及工艺介绍,第一节,4,教学目的：了解抗生素工业生产方法及工业产生的特点;了解抗生素工业生产与一般制药工业比较存在问题;掌握抗生素生产工艺过程。教学重点、难点：生物合成法生产抗生素的工艺过程。,5,工业生产方法,一、抗生素的工业生产方法,6,1、生物合成法,生物合成法（即微生物发酵法）：是利用特定的微生物，在一定的条件下（培养基、温度、pH、通气、搅拌等）使之生长繁殖，并在代谢过程中产生抗生素。然后选用适当化学手段将抗生
2、素从发酵液中提取、精制，最后获得符合药典规定的各种抗生素成品。,7,8,1、生物合成法,传统方法；“工程菌”制造法；细胞融合技术法。,9,传统方法,传统方法目前存在很多不足，因此，人们采用基因工程和细胞融合技术，对抗生素产生菌进行了改造和重新设计，不仅可以制造出许多高效低毒的新型抗生素，还可改革工艺，使抗生素产量成倍地增长。,大多数抗生素是由放线菌产生的。菌种通过从土壤中分离、筛选获得，一般采用深层通风搅拌发酵罐生产。,10,“工程菌”制造法,我国新构建的生产丁胺卡那霉素的“工程菌”，就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得的。新的“工程菌”生产的新抗生素毒副作用小，对耐卡那霉素、庆大霉素致
3、病菌临床疗效显著。,第一次由“工程菌”制造的全新抗生素麦迪紫红素A，是美国报道的。他们将产放线紫红素的部分基因插入产麦迪霉素的放线菌中，构建的“工程菌”产生了全新的抗生素。,11,细胞融合技术法,目前DNA重组技术已广泛用于红霉素、链霉素等20多种抗生素的育种工作，可以预见不久将来会有更多的新型抗生素问世。,对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率比原菌株提高140倍。,12,2、全化学合成法,（即化学合成法）：某些抗生素的化学结构已经明确且较简单时，可采用全化学的方法进行合成制取抗生素。,如：氯霉素、磷霉素等。,13,氯霉素分子结构图,14,氯霉素
4、的合成,15,合成路径,为起始原料,溴代 成盐水解成胺酯化羟醛缩合选择性还原（）苏阿糖型酯水解酸碱中和拆分D（-）苏阿糖型成酰胺,16,全化学合成法的优缺点,优点,效率较高，受影响因素少，克服了发酵法生产的缺点。,17,缺点,导致严重的环境污染问题。,18,3、半化学合成法,即半合成法，将生物合成法制得的抗生素用化学或生化方法引入特定的功能基团,进行分子结构改造而获得的新抗生素品种或制成各种衍生物。,19,:生物合成法制取,:化学方法改造,半化学合成法,此种方法一般分两个阶段进行：,20,许多细菌逐渐出现了耐药性，已经证实某些耐药因子位于细菌内的质粒上，质粒可以在细菌之间转移，结果耐药菌日益增
5、多，抗生素疗效就越来越低。现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大肠杆菌）高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的贵重特效药物先锋霉素（头孢菌素类）、氨苄青霉素，就是这类半合成抗生素类药物。国外已有几十种这类药物在实验室研制成功。,21,半合成抗生素的目的：,增强抗菌力；,1,2,对耐药菌有效；,3,4,降低毒副作用或提高生物有效性。,5,扩大抗菌谱；,便于口服；,22,二、生物合成法生产抗生素的工艺过程,23,抗生素总的生产工艺过程,菌种,孢子制备,种子制备,发酵,精制过程成品检验,提取过程成品包装,发酵液预处理及过滤出厂检验,微生物合成抗生素,上游：菌种保存、选育、孢子及种子制备发酵适
6、宜的培养基碳源 氮源 无机盐（微量元素）前体,下游：提取 预处理 过滤 进一步提取,结晶干燥,纯品,成品:,制剂工作,25,26,1、产生菌种,菌种：来源于自然界，得到能产生抗生素的微生物，经分离、选育和纯化后的物质；保藏：冷冻干燥法制备后，以超低温，即在液氮冰箱(-190-196)内保藏；复壮：一般生产用菌株经多次移植往往会发生变异而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化以提高其生产能力。,27,条 件：生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验，若符合规定，才能用来制备种子；孢子制备：将保藏的处于休眠状态的孢子，在严格的无菌条件下，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温度下培养5-7日或7日
7、以上，这样培养出来的孢子数量还是有限的；扩大培养：必要时可进一步用扁瓶在固体培养基(如小米、大米、玉米粒或麸皮)上扩大培养。,2、孢子制备,28,目 的：使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中；方 法：可用摇瓶培养后再接入种子罐进逐级扩大培养或直接将孢子接入种子罐逐级放大培养。扩大培养：级数通常为二级。,3、种子制备,29,种子扩培工艺流程,1.砂土孢子 2.冷冻干燥孢子 3.斜面孢子 4.药瓶液体培养 5.茄子瓶斜面培养 6.固体培养基培养 7、8.种子罐培养 9.发酵罐,30,在抗生素发酵生产中，由于各菌种的生理生化特性不一样，采用的工艺不同，所需的培养基组成亦各异。即使同
8、一菌种，在种子培养阶段和不同发酵时期，其营养要求也不完全一样。培养基主要成分包括碳源、氮源、无机盐类(包括微量元素)和前体等。,4、培养基的配制,31,(1)碳源,主要用以供给菌种生命活动所需的能量，构成菌体细胞及代谢产物。有的碳源还参与抗生素的生物合成，是培养基中主要组成之一；常用碳源包括淀粉、葡萄糖和油脂类。,32,(2)氮源,主要用以构成菌体细胞物质(包括氨基酸、蛋白质、核酸)和含氮代谢物，亦包括用以生物合成含氮抗生素。有机氮源：黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、尿素、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉和菌丝体等。无机氮源：氨水(氨水既作为氮源，也用以调节pH)，硫酸铵、硝酸盐和磷酸氢二氨
9、等。,33,(3)无机盐和微量元素,抗生素产生菌和其他微生物一样，在生长、繁殖和产生生物产品的过程中，需要某些无机盐类和微量元素。如硫、磷、镁、铁、钾、钠、锌、铜、钴、锰等，其浓度与菌种的生理活性有一定影响。,34,(4)前体(precursor),定义：在抗生素生物合成中，菌体利用它以构成抗生素分子中的一部分而其本身又没有显著改变的物质。前体除直接参与抗生素生物合成外，在一定条件下还控制菌体合成抗生素的方向并增加抗生素的产量。前体的加入量应当适度。,35,(5)培养基的质量,1）在必要时作摇瓶试验以控制其质量；2）培养基的储存条件对培养基质量的影响；3）培养基灭菌过程中温度过高、受热时间过长
10、亦能引起培养基成分的降解或变质；4）培养基初始pH亦要严格按规程执行。,36,5、发 酵,定 义：利用为生物体的代谢作用，并借助于代谢过程的控制来获得产品的过程。目 的：使微生物大量分泌抗生素。,37,5、发 酵,灭 菌：在发酵开始前，有关设备和培养基也必须先经过灭菌后再接入种子。接 种：将活化的菌种转移到无菌的培养基，接种量一般为10%或10%以上。,39,发酵控制,1）发酵时间：视抗生素品种和发酵工艺而定。2）溶 氧：在整个发酵过程中，需不断通无菌空气 和搅拌，以维持一定罐压或溶氧。3）控制灌温：在罐的夹层或蛇管中需通冷却水以维持 一定罐温。4）消 泡：加泡沫剂以控制泡沫，必要时还加入酸、
11、碱以调节发酵液的pH。,40,发酵控制,检测指标：定时取样进行生化分析、镜检和无菌试验。分析或控制的参数有菌丝形态和浓度、残糖量、氨基氮、抗生素含量、溶解氧、pH、通气量、搅拌转速和液面控制等。,41,目 的：分离菌丝、去除杂质；多数抗生素品种在生产过程中，当发酵结束时，抗生素存在于发酵液中；个别品种当发酵结束时抗生素大量残存在菌丝之中，在此情况下，发酵液的预处理应当包括使抗生素从菌丝中析出，使其转入发酵液。,6、发酵液的过滤和预处理,42,发酵液的预处理,加热、大幅度调pH和加絮凝剂等方法使蛋白质变性；加入草酸、三聚磷酸钠（Na5P3O10）、黄血盐等可除去Ca2+，Mg2+，Fe2+等无机
12、离子。,43,发酵液的过滤,板框过滤机,鼓式真空过滤机,44,自动出渣离心机,倾析器,发酵液的过滤,45,7、抗生素的提取,提取目的：从发酵液中制取高纯度的符合药典规定的抗生素成品。提取要求：1)时间短；2)温度低；3)pH宜选择对抗生素较稳定的范围；4)勤清洗消毒(包括厂房、设备、管路并注意消灭死角)。提取方法：1)溶媒萃取法；2)离子交换法；3)其他提取方法,46,溶媒萃取法,利用抗生素在不同pH条件下以不同的化学状态(游离酸、碱或成盐)存在时，在水及与水互不相溶的溶媒中其溶解度不同的特性，使抗生素从一种液相(如发酵滤液)转移到另一种液相(如有机溶媒)中去，以达到浓缩和提纯的目的。,47,
13、离子交换法,利用某些抗生素能解离为阳离子或阴离子的特性，使其与离子交换树脂进行交换，将抗生素吸附在树脂上，然后再以适当的条件将抗生素从树脂上洗脱下来。,48,缺点：生产周期长，对某些产品质量不够理想,优点：成本低、设备简单、操作方便,离子交换法,49,其他提取方法,由于近年来许多抗生素发酵单位已大幅度提高，提取方法亦相应适当简化。直接沉淀法就是提取抗生素的方法中最简单的一种。例：四环素的提取,50,8、抗生素的精制,对产品进行精制、烘干和包装阶段要符合“药品生产管理规范”（GMP）的规定。,51,抗生素精制的方法,1、脱色和去热原质 2、结品和重结晶 A.改变温度结晶 B.利用等电点结晶 C.
14、加成盐剂结晶 D.加入不同溶剂结晶 3、其他精制方法,52,1、脱色和去热原质,色素是发酵过程中产生的代谢产物，与菌种及发酵条件有关，常用活性炭脱色。热原质是在生产过程中由于被污染后由杂菌所产生的一种内毒素。G-产生的热原反应高于G+，是多糖磷类脂质和蛋白质的结合体，引起恶寒高热，甚至休克。常用活性炭吸附或超微过滤办法去除。,53,2、结晶和重结晶,A.改变温度结晶 利用抗生素在溶剂中的溶解度随温度变化而显著变化的这一特性来进行结晶。例:制霉菌素的浓缩液在5条件下保持4-6h后即结晶完全，分离掉母液、洗涤、干燥、磨粉后即得到制霉菌素成品。,54,当将某一抗生素溶液的pH调到等电点时，它在水溶液
15、中溶解度最小，则沉淀析出。例：6-氨基青霉烷酸(6-APA)水溶液当pH调至等电点(4.3)时，6-APA即从水溶液中沉淀析出。,B.利用等电点结晶,55,C.加成盐剂结晶,在抗生素溶液中加成盐剂(酸、碱或盐类)使抗生素以盐的形式从溶液中沉淀结晶。例：在青霉素G或头孢菌素C的浓缩浓中加入醋酸钾、即生成钾盐析出。,56,D.加入不同溶剂结晶,利用抗生素在不同溶剂中溶解度大小的不同，在抗生素某一溶剂的溶液中加入另一溶剂使抗生素析出。例：巴龙霉素具有易溶于水而不溶于乙醇的性质。在其浓缩液中加入10-12倍体积的95%乙醇，并调PH至7.2-7.3使其结晶析出。,57,3、其他精制方法,(1)共沸蒸馏
16、法(2)柱层析法(3)盐析法(4)中间盐转移法(5)分子筛,58,9、成品检验中华人民共和国药典,抗生素成品常规检验的主要项目有：鉴别实验：用化学或生物方法证明是何种抗生素；效价测定：测定有效成分的含量；毒性试验：限制产品中的致毒杂质；无菌实验：检查有无杂菌污染；,59,热原质试验：限制产品中致热杂质；水分测定：限制过高水分，以免影响稳定性；pH测定：规定水溶液的酸碱度，保证产品稳定 和临床的安全应用；溶液澄清度检查：限制不溶性杂质混入；降压试验：限制降低血压的杂质。,60,10、成品的分包装,就是将大包装原料药进行小包装或加工成多种类型的抗生素剂型，如果是注射用的抗生素剂型，还必须在无菌条件
17、下进行。,61,抗生素工业生产特点,三、抗生素工业生产特点,62,1 菌体的生长与产物的形成不平行,2 理论产量难以用物料平衡来计算,3 生产稳定性差,63,四、与一般制药工业相比较的特殊问题,64,1、染菌问题：,克服染菌是发酵成败的重要因素，染菌问题虽已得到重视，但由于设计技术、设备、管理、操作等方面的因素，有待继续进行研究和解决。,65,2、粮食消耗问题,每生产一公斤抗生素，往往要消耗25-200公斤粮食；解决粮耗问题要从提高生产水平着手，如筛选高产菌株、降低染菌率、采用合理的培养基配方、以粗粮或非粮原料替葡萄糖、乳搪、蛋白陈等，以合成消沫剂代替食用油，降低发酵终止时的残糖，改进发酵工艺
18、、不断提高提取收率。,66,3、动力消耗问题,蒸汽、压缩空气、水、电等是抗生素生产必须具备的耗能四大公用系统。因此，如何从提高产量、降低消耗、节约能源方面进行技术革新又是一个十分重要的问题。,67,4、稳定性和质量问题,生产过程中要严格控制工艺条件，使抗生素的破坏尽量减小，以利于提高产量，保证质量。,68,五、抗生素工业生产研究范畴及趋势,69,新抗生素产生菌的筛选选育高产菌株抗生素生物合成机制以及产生菌的代谢调控研究,生物化学和生物学上的研究,70,化学方面的研究,抗生素的化学性质与结构改造已知抗生素结构抗生素的化学检定方法抗生素生产、应用的劳动保护和工业三废处理,71,生化工程方面的研究,发酵罐结构对发酵过程的显著影响发酵液的过滤和预处理生产设备,
