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1、蛋白质抗饥饿表达策略研究与应用北京理工大学范舜骅】，范云娟1,郭丽微I（1.北京理工大学生命学院，北京市海淀区100081）孙丽超副研究员，霍毅欣教授中文摘要：本研究提出了基于密码子敏感性的蛋白质抗饥饿表达策略，旨在通过将氨基酸浓度敏感型密码子替换为氨基酸浓度不敏感型或低敏感型密码子，增强目标蛋白质在氨基酸胁迫条件下的表达。以异丁醇生产过程为例，本研究通过敲除旁路基因途径，优化异丁醇生产菌株。此外，对限速酶IIVCD进行了密码子敏感性优化，以提升酶的稳定表达。通过以上策略，将优化后的异丁醇合成途径整合到丙氨酸高产菌株中，研究成果显示，这一策略分别提高了异丁醇产量的34.44%、40.35%、4
2、2.69%。实验首次将密码子敏感性应用于蛋白质抗饥饿表达策略的开发，将该策略应用于工业化发酵菌株的改造，能够使改造菌株在氨基酸匮乏条件下集中资源优先翻译目标化合物的合成途径，在不影响细胞生长的条件下实现资源配置的优化，从而有助于目标化合物和目标蛋白质的持续高效生产，进而提升菌株的生产性能。英文摘要：Thisstudyproposesaproteinanti-starvationexpressionstrategybasedoncodonsensitivity,aimingtoenhancethetargetproteinsexpressionunderaminoacidstresscondit
3、ionsbyreplacingtheaminoacidconcentration-sensitivecodonswithinsensitiveorlow-sensitivitycodons.Usingtheisobutanolproductionprocessasanexample,thestudyoptimizedtheisobutanol-producingstrainsbyknockingouttheside-pathwaygenes.Additionally,therate-limitingenzymeIlvCDwasoptimizedforcodonsensitivitytoenha
4、nceitsstableexpression.Throughthesestrategies,theoptimizedpathwayforisobulanolsynthesiswasintegratedintothehigh-producingstrainsofalanine.Theresearchresultsshowedthatthisstrategyimprovedisobutanolproductionby34.44%,40.35%,and42.69%respectively.Theexperimentappliedthecodonsensitivitystrategyforthefir
5、sttimeinthedevelopmentofaproteinanti-starvationexpressionstrategy.Applyingthisstrategytothetransformationandproductionofindustrialfermentationstrainsallowsthemodifiedstrainstoprioritizethetranslationofthesynthesispathwayforthetargetcompoundunderaminoaciddeficiencyconditions,optimizingresourceallocat
6、ionwithoutaffectingcellgrowth.Thiscontributestothecontinuousandefficientproductionofthetargetcompoundandprotein,ultimatelyimprovingtheproductionperformanceofthestrain.关键词：密码子；蛋白质表达；异丁醇；限速酶一、绪论气候变化是威胁人类生存与发展的全球性问题，主要由工业革命以来人类活动所造成的二氧化碳排放所致，其中，石油基能源的开采和利用是二氧化碳排放的主要源头。目前，减少二氧化碳排放已经成为了世界各国关于环境保护的主要议题之一。
7、2020年，我国提出要力争在2030年前实现碳达峰，2060年前实现碳中和。应对气候变化的关键在于“控碳”，相较于汽油、柴油等非可再生的石油能源，使用非粮作物、甚至农业废弃物为原料所生产的可再生生物燃料可以大幅减少二氧化碳的排放，因此，发展可再生的清洁燃料成为了世界各国实现能源替代、保护环境的重要战略之一。异丁醇属于含有三个以上碳原子的高级醇类，因具有高热值、高辛烷值、低吸湿性、低挥发性和低腐蚀性等优势，可以与汽油以任意比例混合甚至完全取代汽油，因此被认为是最具前景的燃油补充品和替代品。异丁醇每年的全球市场需求高达411亿加仑，市值达到1070亿美金。异丁醇作为一种氨基酸衍生物，可以通过微生物
8、发酵的方法得到，但异丁醇菌株在工业发酵过程中常常面临着蛋白质表达水平下降、生长受限、生产停滞等瓶颈问题，严重地限制了异丁醇的发酵产量L究其原因，是因为合成蛋白质国家级大学生创新创业训练计划支持项目O作者简介：范舜骅（2001-）、男，江苏苏州人，生物技术，2019级本科生，碳氮中和的微生物细胞工厂构建。所需的氨基酸原料被源源不断地用于生产异丁醇，氨基酸资源逐渐匮乏，菌株开始进入“饥饿”状态，从而引发蛋白质表达水平的降低和生产效率的下降。蛋白质是生命活动的主要承担者，也是异丁醇生产过程中的重要执行者，实现饥饿条件下的蛋白质持续表达，有助于创建抗饥饿的工业发酵菌株，实现有限碳氮资源条件下的异丁醇发
9、酵产量提升。因此，本研究旨在解决工业发酵生产中营养匮乏引发的生产效率下降的问题，通过碳氮资源的重新分配和利用，促进新一代清洁能源的高效稳定生产，对于创造碳氮中和的生物制造产业链具有重要的理论与应用意义。二、基于密码子敏感性的蛋白质抗饥饿表达策略开发（一）密码子敏感性影响蛋白质表达速率IRNA的氨基酸负载水平是蛋白质表达速率的关键因素【9.。氨基酸饥饿时，用敏感密码子替代原始密码子会导致蛋白质翻译迟缓，敏感性的密码子会维持较低的负载水平U,但低敏感型密码子所对应的tRNA对氨基酸浓度不敏感，氨基酸胁迫条件下仍能保持较高的负载水平（图1）。因此，将目标基因的高敏感型密码子替换为低敏感型密码子，有望
10、增加目标蛋白质在氨基酸饥饿状态下的表达量，进而提升工业菌株发酵后期的产物产量。r1 tRNA,te (ATC) tRNA,*e (AIA) Ile图1密码子敏感性对IRNA负载水平的影响（二）基于低敏感型密码子替换的蛋白质抗饥饿表达对GFP基因的序列进行筛查，分析其中具备密码子敏感性的氨基酸位点，通过序列分析发现，该基因所编码的GFP蛋白中有9个Ala,7个Arg,8个Gln,17个Val,15个Thr。将GFP中所有丙氨酸和缀氨酸的密码子分别替换成相应的敏感性相对较低的密码子GCU（密码子频率1.52；密码子敏感性2）和GUA（密码子频率1.09；密码子敏感性10）,分别获得GFP-Ala-
11、9GCT（SEQIDNo：1）和GFP-Val-HGTA（SEQIDNo：2）,将改造的GFP序列分别插入pET28a质粒中，导入大肠杆菌BL21菌株。将携带敏感性相对较低的密码子替换质粒的菌株接种至02xLB培养基，以含有野生型GFP基因的菌株作为对照，采用酶标仪检测菌体的OD600值和荧光强度，比较敏感性相对较低的密码子替换对氨基酸胁迫条件下GFP基因表达的上调影响，实验结果表明（图2）,丙氨酸或者缎氨酸的敏感性相对较低的密码子G，替换均可以提高GFP在氨基酸胁迫条件下的表达。图2低敏感性密码子对GFP表达的影响利用低敏感型密码子改造策略，对G/T基因中的丙氨酸或者缀氨酸密码子进行改造，可
12、以显著提高G/P在氨基酸胁迫条件下的表达量。三、基于密码子敏感性的蛋白质抗饥饿表达策略应用(一)基于低敏感型密码子替换的异丁醇途径限速酶改造frdBC为延胡索酸还原酶亚基基因，IdhA为异柠檬酸脱氢酶的基因，pflB为丙酮酸甲酸裂解酶，adhE为融合的乙醛辅酶A脱氢酶和铁依赖性醇脱氢酶，fnr为DNA结合转录双重调节因子，抑制参与有氧呼吸的基因，激活无氧呼吸所需的基因。在对异丁醇进行生物合成时，旁路途径中fm基因会导致葡萄糖的分流，frdBC基因会导致磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate,PEP)的分流，IdhA基因会导致丙酮酸的分流，进而生成各种副产物，进而使得异丁静的产
13、量下降(图3)。为了解决这一问题，本研究尝试利用CRISPR-Cas9高效染色体编辑系统构建质粒对其旁路途径的相关基因进行敲除来提高异丁醇的产率。对密码子进行优化是提高蛋白质表达水平最常用的手段。目前最常见最广为使用的针对密码子的优化策略是利用密码子偏好性，用频率最高的密码子替换掉频率较低的密码子，理论上可以通过改变对应tRNA的浓度来影响蛋白表达的速度。但在实际生产中我们发现，细胞内的IRNA浓度并不与蛋白表达速度直接相美,且若是采用高频密码子策略，很可能会因为蛋白表达前期tRNA及氨酰化IRNA的快速消耗而导致后期翻译表达的过早终止，还可能会引入错误的氨基酸导致蛋白功能的丧失或异常。这些问
14、题显示了针对频率高低进行密码子优化策略的局限性。本文采用的低敏感性密码子策略相较于前者具有明显的优势，采用频率相似但敏感性较低的同义密码子优化序列，这样在翻译密码子合成蛋白质的过程中，既不会因为密码子偏好性影响蛋白的表达量，同时又考虑了氨基酸饥饿的胁迫情况，通过低敏感性密码子对应tRNA较高水平的氨酰化能力，保证翻译后期蛋臼的持续高效表达。本文基于低敏感性密码子优化策略对己知的限速酶IlvCD进行改造，在氨基酸饥饿的胁迫条件下，异丁醇的高效微生物合成受到翻译水平的限制。2019年，GhoSe团队对异丁醇合成途径进行了代谢方面的研究，通过对途径中有效流动的醐的比例进行优化和分析，确定了酮酸还原是
15、限速步骤，即乙酰羟酸异构还原酶(IIVC)和二羟酸脱水酶(IIVD)是限速酶，需要最高水平的酶表达，/CO基因中，编码缴氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的密码子数目分别为70、100和62,将小CO中级氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的密码子分别替换成其同义密码子中对氨基酸浓度敏感性最低的密码子GTT、TTG.ATAo随后进行密码子优化序列的基因合成和改造菌株SLWl(Vai,GUU)、sLW2(Leu,UUG)和SLW3(He,AUA)的构建(图4A)。上述改造菌株和野生型菌株进行发酵和ilvC酶活的测试。发酵24h后，改造菌株sLWl(Vai,GUU)sLW2(Leu,UUG)和SLW3(He,AUA)的Il
16、VC活性相较未改造的菌株SLWo分别提高了31.14%,58.61%和46.56%。在96h发酵时间内，改造菌株SLWl(Va1,GUU)、sLW2(Leu,UUG)和sLW3(He,AUA)的IlVC活性变化不大，而未改造的菌株SLWO的IlVC活性发生了显著的下降。与24h的UvC酹活相比，第96h的IlVC酶活降低了78.5%(图4B)。该结果表明低敏感型密码子替换能够提高氨基酸胁迫条件下IlvCD蛋白的表达量及其酶活。CO14三GfclCOMBIPEFT.SucaraieIMCAcatyIXoA一.一FyrvWftIfUctoto一人P8IMlKAEmendlsob*ftyl20OrP
17、m培养过夜，以1%的接种量转接至含有20mLM9培养基(添加40g/L葡萄糖)的25OmL带螺旋盖锥形瓶中，转接后置于30发酵96h,转速250rpm.每24h取一次样，采用GC进行产量分析，确定三种改造菌株相比对照菌株的异丁醇增产幅度。经过摇瓶发酵96h后，改造菌株SLWl(Va1,GUU)、sLW2(Leu,UUG)和sLW3(He,AUA)的异丁醇产量相较未改造的菌株sLW0分别提高了40.2%,34.4%和42.6%(图5ABC)。以摇瓶发酵产量提升最高的菌株SLW3(He,AUA)为例，采用发酵罐验证其摇瓶发酵结果。改造菌株sLW3(11e,AUA)的最终异丁醇产量高达49.75g/
18、L(图5D),相较未改造的菌株SLWO提高了68.70%。因此，利用敏感性较低的密码子优化策略有利于异丁醇的生产。 WT LeiMC-TTG141怆1(8 8 4 2 C1) -OCiS-WT IIe-IC-ATAO 24 4 72 Time (h)图5低敏感型密码子替换对异丁醇摇瓶发酵产量的影响A：质粒p(X)8(Leu-LS,UUG)改造后的异丁醇产量(96h)提高了34.44%；B;质粒p(X)9(Val-ORGUU)改造后的异丁醇产量(96h)提高了40.35%；C:质粒p010(Ile-LS,AUA)改造后的异丁醉产量(96h)提高了42.69%：D：sLW3(lie,AUA)的最终
19、异丁醇产量高达49.75g/L。四、结论与展望本研究首次将密码子敏感性策略用于工业化发酵生产过程，在不影响细胞生长的条件下实现资源配置的优化，有助于创建抗饥饿的工业发酵菌株，实现有限碳氮资源条件下的发酵产量提升。本研究以异丁醇的合成为例，首先建立了基于密码子敏感性的氨基酸高产菌株筛选筛选系统。其次，本研究对异丁醇生产底盘菌株进行了优化，设计并构建质粒将异丁醉副产物途径相关酶的基因进行敲除，以减少异丁醉合成途径底物的消耗和副产物的生成。最后，本文基于密码子敏感性优化了异丁醇合成途径限速酶IlvCD。将限速防IlVCD序列中亮氨酸、异亮氨酸和缎氨酸的高敏感性密码子替换为低敏感性密码子并构建了质粒。
20、96h的发酵数据显示，异丁酥产量分别提高了34.44%、40.35%、42.69%,与野生型未改造的菌株相比均有明显提升，且异亮氨酸密码子敏感性优化的菌株产量提升最为显著。这表明了本实验在提升了异丁醇产量的同时进一步证明了敏感性密码子优化策略的可行性并提供了实验依据，一定程度上解决了氨基酸胁迫带来的翻译后期生产停滞及底物副产物竞争等问题。本项目建立了新型的蛋白质抗饥饿表达策略，成功实现了饥饿条件下的蛋白质持续表达，该策略可以应用于抗饥饿的工业发酵菌株构建，能够解决工业发酵生产中营养匮乏引发的生产效率下降的问题，通过碳氮资源的重新分配和利用，促进新一代清洁能源的高效稳定生产，对于创造碳氮中和的生
21、物制造产业链具有重要的理论与应用意义。参考文献：1 RaupachMR,MarlandG.CiaisRetal.GlobalandregionaldriversofacceleratingCO2emissions.ProcNailAcadSciUSA.2007Jun12;104(24):10288-93.2 ZhangR,HanaokaT.Cross-cuttingscenariosandstrategiesfordesigningdecarbonizationpathwaysinthetransportsectortowardcarbonneutrality.NaiCommun.2022Ju
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