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1、基因工程原理方法及应用,蒋爱芹,本课程讨论4个问题：,1 什么是基因工程基因工程的概念2 为什么能进行基因工程基因工程的原理和技术3 怎样进行基因工程DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达4 基因工程的应用和前景对于医学来说即生产基因工程药物和疫苗、开展基因治疗等,第一章 基因工程的基本概念,D 基因工程的基本用途,C 基因工程的影响与意义,A 基因的概念,B 基因工程的诞生和发展,E 基因工程的支撑技术,1、基因定义的发展,一基因（gene),19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学,20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因连锁互换 基因学,1944年 艾弗瑞 肺炎双
2、球菌转化实验 遗传物质DNA,分子遗传学,1953年 沃森-克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学,年 的豌豆杂交试验,1822-1884,分离定律自由组合定律,摩尔根（18661945）,基因连锁互换规律,1953年，DNA双螺旋模型的诞生,肺炎双球菌转化实验,爱弗莱证实转化物质是 DNA,2、基因的现代定义基因从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），可以由于突变生成等位基因变异体（体细胞父源和母源；正常和突变基因）；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。,二、基因工程（genetic eng
3、ineering）1、定义 将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。,1）第一个实现DNA重组的人Berg1972年，Berg用E.coR切割SV40DNA和phageDNA，经过连接组成重组的DNA分子。Berg是第一个实现DNA重组的人2）第一个取得基因工程成功的人Cohen1973年，Cohen Group将E.coli的tetr质粒psclol和ner
4、srR6-3质粒体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrNer,实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子，这一年被定为基因工程诞生的元年,2、基因工程发展史,1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发表了题为“Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and
5、the galactose operon of Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2904-2909,1972”，标志着基因工程技术的诞生。,第一个重组体构建,SV40病毒是猿猴病毒，是一种直径为450的球形病毒，分子量为28106道尔顿。SV40的DNA是环状双链结构，全长5243个碱基对。SV40DNA上有一个限制性内切酶EcoR的切点。,当获得二聚体SV40DNA后，Berg等就证明了环状DNA被内切酶切成线性DNA后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。于是他们进行第二步的实验就是从dvgal DNA中制备含有E.coli的半乳糖操
6、纵子DNA，用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功。,第一个有功能重组体的构建 虽然Berg的工作具有划时代的意义，但是他们并没有证明体外重组的DNA分子具有生物学功能。1973年，等在美国PNAS上发表了题为“Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmid In Vitro”（S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,and R.B.Helling,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70:3240-3244,1973）的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达,从而完善了Berg开
7、创的基因重组技术。,Boyer and Cohen,3）1976年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司,Boyer,Swanson,4）1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂,insulinFrom Genetech,5）1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉,（一）理论上的3大发现：1）20世纪40年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是DNA。2）20世纪50年代，Watson-crick提出了DNA结构的双螺旋结构模型，搞清楚了生物遗传物质的分子机制。3）20世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式：DNARNAPr,破译了全部遗传密码，
8、43。,3、基因工程3大理论,3大技术准备：,（二）技术上的3大发明：1）“基因剪刀”限制性内切酶的发明（1）20世纪4060年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。（2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilus inffuenzae）分离纯化了Hind，取得了突破，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。,1970年，从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶,1978年诺贝尔奖,Smith HO,Wilcox KW.A res
9、triction enzyme from Hemophilus influenzae.I.Purification and general properties.J Mol Biol.1970;51(2):379-91,2）载体(“交通工具车子”)基因工程技术诞生的第二个技术准备（1）有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个车子将重组DNA送到宿主细胞中去。（2）1946年起，Lederberg就研究细菌性因子（F因子），50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。（3）然而，直到1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因
10、工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。,3）逆转录酶1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。（原因如下）（1）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应的产物。（3）经过逆转mRNAcDNA(complementory DNA)文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。,4、基因工程相关的概念：（一）克隆（clone,cloning）（1）作为名词基因型（genetyp
11、e）相同的细胞或生物体的一个群体，通过无性繁殖获得。带有相同插入顺序的重组DNA分子的1个群体，如描述一个微生物菌落，这些微生物带有共同的插入了特定DNA片断的载体分子。（2）作为动词，即利用体外DNA重组技术将一个特定的基因或DNA顺序插入一个载体分子。由于整个操作在分子水平上进行，所以称为分子克隆（molecular cloning）。,（二）重组DNA技术(DNA recombination technique)是用酶学的方法将不同来源的DNA在体外切割，连接组成一个杂合的DNA分子的技术。DNA重组技术是基因工程的核心内容。（三）生物工程（Biologic engineering）：是
12、更大范围内生产产品的工程技术，是现代生物学中一切工程技术的总称，包括：基因工程、酶工程、细胞工程、微生物工程、发酵工程等。,三基因工程的意义人类对自然的干预（一）遗传和变异是生物学的一对重要概念。1.遗传赋予生物种的稳定，保证生物种的延绵不断。2.变异赋予生物种的进化，保证生物种对环境的适应。3.遗传和变异这一对矛盾在一个生物体内统一起来。4.在生物演变的历史长河中，自然发生的变异是相当相当缓慢的。5.随着生物科学的发展，尤其是基因工程技术的诞生，人类开始干预生物的变异（福耶祸耶？无法定论）6.经典的遗传学千百万年才能积累出现的有利的变异，通过基因工程手段几十年乃至几年就可以实现。,Dolly
13、 The Sheep,Hello DollyDolly was the first mammal cloned from an adult cell.She was born in 1997 and died in 2003.She was 6 when she died,about half the usual age for a sheep,是2010年5月20日美国科学家向世界宣布的、首例人造生命完全由人造基因控制的单细胞细菌诞生，并将它命名为“人造儿”。意义：新的生命体可以在实验室里“被创造”，而不是一定要通过“进化”来完成,人造活细菌的细胞核,(二)多利1997223，Nature杂
14、志报道，英国爱丁斯堡罗斯林研究所和PPL生物技术公司已经成功克隆了一只名叫多利的绵羊（19972003/7/12）。为什么以前胚胎克隆没有在世界上引起轩然大波呢?它推翻了遗传学上一条上百年的定律：体细胞功能高度分化，不可能重新发育成个体。,（三）多利诞生的过程1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。2.取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出细胞核换上第一只羊乳腺细胞核（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。3.将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一样），最后产下多利。这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。,（
15、四）此克隆非彼克隆（五）克隆是一把双刃剑克隆对人类社会伦理道德提出了一场非同寻常的挑战,四 基因工程的基本用途,基因工程药物转基因植物转基因动物基因治疗基因芯片技术,Bacteria can be engineered to“eat”oil spills.,转基因植物,转基因动物,Human DNA in a Goat Cell,This goat contains a human gene that codes for a blood clotting agent.The blood clotting agent can be harvested in the goats milk.,.,T
16、ransgenic Goat,五 基因工程的基本形式,第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程,第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程,第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程,第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程,第二代基因工程（蛋白质工程）以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为人类合乎需要的新的突变蛋白质。,第三代基因工程（途径工程）借助DNA重组技术优化细胞的酶活性、运转及调控功能，从而改变细胞的特性。,第四代基因工程（人类基因组计划）于20世纪80年代提出的，由国际合作组织包括有美、英、日、中、德、法等国参加进行了人体基因作图，测定人体23对染色体由3109核苷酸组成的全部DNA序列，于2000年完成了人类基因组“工作框架图”。2001年公布了人类基因组图谱及初步分析结果。其研究内容还包括创建计算机分析管理系统，检验相关的伦理、法律及社会问题，进而通过转录物组学和蛋白质组学等相关技术对基因表达谱、基因突变进行分析，可获得与疾病相关基因的信息。,六 基因工程的支撑技术,凝胶电泳技术分子杂交技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术聚合酶链反应（PCR）技术,
