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1、二 基因表达载体的构建,思考与讨论：,1 基因载体必须具备的基本条件是什么？,2 基因工程可做载体的结构有那些？最常 使 用 的载体是什么？,3 请图示大肠杆菌质粒结构。,4 从苏云金芽孢杆菌细胞DNA分子中提取得到 Bt毒蛋白基因能否直接进入普通棉细胞中？如果把目的基因人工注射到普通棉细胞中，那么该基因在棉细胞中会稳定存在，复制和表 达吗？,5 假如你是一个基因工程操作者，若使目的基因 进入棉细胞，并能在棉细胞中遗传和表达，你 应当采取什么办法？你能说出其中的理由吗？,（一）基因表达载体的构建,2 请你定义：基因表达载体构建之含义？,1 基因工程操作中，构建基因表达载体之目的 是什么？,将目
2、的基因、启动子和终止子科学按装在经修饰和改造完备的载体之上。,确保目的基因在受体细胞中稳定存在、复制、遗传和表达，使其发挥作用。,3 基因表达载体之基本组成是什么？,（1）结构基因即提取的目的基因核苷酸序列，负责 编码目标蛋白质。,（2）启动子位于编码蛋白质结构基因之首一段殊结 构的DNA片段，RNA聚合酶的识别部位和结合部位。,（3）终止子位于编码蛋白质结构基因末端一段特殊 结构的DNA片段，具有终止基因转录过程的作用。,（4）复制原点能够自我复制保证目的基因在受体细 胞中复制遗传和表达。,（5）遗传标记基因检测受体细胞中是否含有目的基 因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,请你以质粒作载
3、体构建基因表达载体之模式图,基因表达载体,基因表达载体,启动子,复制原点,终止子,插入目的基因,遗传标记基因,4 建构基因表达载体方法,（2）用同种限制酶切割目标DNA分子，截取目 的基因，使其产生与质粒相同的末端。,（1）用某种限制酶如EcoRI限制酶，在基因插 入位点切割质粒，使质粒出现一个切口，露出两个黏性末端。,（3）依据目的基因表达的特点和位置，用限制 酶切割受体细胞相应的控制元件 启动 子和终止子。,（4）用限制酶将启动子和终止子与目的基因连 接起来，成为一个整体。,（5）将目的 基因 插入质 粒切口处，用 Ecoli DNA连接酶把基因与质粒缝合起来，成功 创建一个重组DNA分子
4、。,建议模拟完成建构大肠杆菌基因表达载体，并写出具体步骤。,三 将目的基因导入受体细胞,基因导入受体细胞的标志是什么？,1目的基因与载体在受体细胞共同复制、遗传和表达。或目的基因插入细胞染色体上DNA分子之中，随同受体细胞DNA分子复制、遗传和表达。2 实际上外源目的基因变成了受体细胞的一部分，这种现象叫做转化。,2 目的基因导入受体细胞遵循的基本原理是什么？,通常借鉴细菌或病毒侵染细胞和寄生之途径。,（一）将目的基因导入植物细胞,农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，在自然条件下易感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染力。,2 感染原理：,当植物体受到损伤时，伤口处细胞分泌大量的
5、酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的TDNA分子可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色DNA分子之上。,1 农杆菌转化法,目标,（二）将目的基因导入动物细胞,2 实例,基因工程培育转基因动物最常用、最有效的 方法显微注射技术,（1）将含有目的基因的表达载体提纯；,（2）从雌性动物体内取出受精卵细胞。,（3）用显微注射仪把目的基因注射到受精卵细胞；,（4）把含有目的基因的受精卵移植到雌性动物子 宫或输卵管发育成具备新性状的动物。,世界上第一例体型比普通小鼠大1.8 倍的转基因“超级小鼠”就是用显微注射技术获得成功。,（三）将目的基因导入微生物细胞,目的基因导入大肠杆菌最常用的转化方法是：,1 用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于能 够吸收环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。,2 用大肠杆菌质粒与目的基因进行重组形成基因质粒重组DNA分子。,3 将基因质粒重组DNA分子与感受态细胞混合，在一定温度下，感受态细胞吸收周围重组DNA分子，完成转化过程。,
