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1、红肉苹果酒多酚抑制癌细胞增殖机制的研究技术报告“红肉苹果酒多酚抑制癌细胞增殖机制的研究(项目编号:S)”,于2020年立项。2021年9月项目实施完成，现将项目实施情况总结如下：一、项目名称红肉苹果酒多酚抑制癌细胞增殖机制的研究二、项目来源项目“红肉苹果酒多酚抑制癌细胞增殖机制的研究，于2020年立项。三、主要研究内容(1)红肉苹果酒多酚的结构表征；(2)红肉苹果酒多酚的制备；(3)红肉苹果酒多酚抑制癌细胞(MDA-MB-231)增殖研究；(4)红肉苹果酒多酚对癌细胞周期的影响；(5)红肉苹果酒多酚对癌细胞凋亡的影响；四、技术方案及研究方法4.1 取样红肉苹果酒由指导老师李翠霞所在团队培育出来
2、的红肉苹果优良品种，美红，酿制而成。4.2 试验方法421苹果酒酚类物质的提取苹果酒中酚类化合物的提取参照Lietal.,(2006)中描述的方法进行，稍作修改，具体操作步骤如下:1)20mL苹果酒与20mL乙酸乙酯混合，室温下于摇床上避光提取30min,收集有机相；2)重复步骤1两次；3)用ImOI/LNaOH使步骤2提取后的酒样PH值调至7.0；4)重复步骤1-2；5)合并所有收集的有机相，37温度下旋转蒸发至干燥，并用4mL色谱甲醇溶解保存于-20备用。4.2.2 红肉苹果酒总酚含量测定总酚含量测定采用福林法测定。取3mL稀释数倍的酒样加3mLFC试剂，力口9mL7.5%Na2CO3反应
3、6()min后，在分光光度计下测765nm下的吸光度。以没食子酸为标准品，绘制标准曲线。4.2.3 红肉苹果酒总类黄酮含量测定吸取0.5mL稀释数倍的酒样放入离心管中，再加入3mL5%NaN23mL10%AI(No3)3、4mL2molLNaOH,放置15min后于51Onm处测定吸光度值。以上海易恩化学技术有限公司的曲克芦丁为标准品，制作标准曲线，红肉苹果酒中TF(totalflavonoids)含量用芦丁当量(RE)表示。4.2.4 红肉苹果酒总花青昔含量测定花青甘含量采用PH示差法测定，略作修改。样品测定：取稀释数倍的酒样各3.0mL,分别与12mL的PH为1.0的KCl溶液和PH为4.
4、5的NaAc溶液在25mL的棕色容量瓶中混合,避光提取2h后，在520nm和700nm处分别测定反应液的吸光值差,每个样品进行三个独立的生物学重复。总花青甘的含量按以下公式计算：A=(OD520-OD700)pH1.0-(OD520-OD7(X)pH4.5W=(A*MW*DF*1000)(*l)式中：w：酒样中花青苜的含量，单位mg/L；MW：为Cy-3-G的相对分子质量(449.2)；DF：稀释倍数；:Cy-3-G(Cyanidin-3-glucoside)的摩尔消光系数，为29600。4.2.5 酚酸的HPLC分析样品中酚酸含量的测定参照尹承苗等人(2013)描述的方法进行，具体操作步骤如
5、下：1)提取获得的各种酚类样品经过0.22m过膜；2)色谱条件：色谱柱为AeClaim120C18(150mmX3mm,3Um,Dionex,美国)，柱温保持在30,流动相A为乙懵，流动相B为ddH20(乙酸调PH至2.6),流速为0.5mLmin,进样体积为5UL,进样方式为自动进样，检测波长为280nm；3)酚酸组分的定性和定量分析用肉桂酸，水杨酸，香豆素，苯甲酸，阿魏酸，香兰素，丁香酸，香兰素，绿原酸，对羟基苯甲酸，原儿茶酸，没食子酸等相应的外部标准品进行。4.2.6 红肉苹果酒抗氧化能力的测定4.2.4.1 FRAP法抗氧化能力的测定采用Benzie#Strain(1999)描述的方法
6、进行。标准曲线制定：以Trolox为标准品测定标准曲线，标曲溶液配制方法：称取50.06mgTrolox用水定容之至IOomL(2mM)。使用时再用蒸储水稀释成若干个不同的浓度：0、0.2、0.4、0.6、0.8mMo样品测定：取100mLPH为3.6,300mM乙酸缓冲液，10mL20mMFeCI36H2O与IOmLIOmmolLTPTZ溶液，在棕色容量瓶中混合，放入37恒温水浴锅中反应5min,Z9mL(配制120mL)反应好的的溶液与50L样品，5mL的超纯水混匀，37反应Iomin后，595nm下测其吸光度。红肉苹果酒抗氧化能力以TEAC表示(mmolTroloxZL)。4.2.4.2
7、 ABTS自由基清除法参考孙海燕等人描述的方法来测定红肉苹果酒中ABTS+的清除能力。标准曲线绘制：以美国Sigma-Aldrich公司的TrOlOX为标准品来测定标准曲线，标曲溶液配制方法：称取50.06mgTrolox用水定容之至100mL(2mM)。使用时再用蒸馈水稀释成若干个不同的浓度:0、0.2、0.4、0.6、0.8、1和1.2mM。样品测定：取17mLABTS工作液与稀释数倍的酒样50L在黑暗中反应,反应8min后测定反应体系在734nm的吸光值。每个样品进行三个独立的生物学重复。用每升红肉苹果酒亳摩尔Trok)XeqUiValem(mmolTE/L)表示红肉苹果酒清除ABTS+
8、的能力。4.2.4.3 DPPH自由基清除法吸取100OL稀释红肉苹果酒样与28mLDPPH甲醇溶液放入棕色容量瓶中,反应半小时。测定517nm处的吸光度。结果以TEAC表示(mmolTrolox/L)。反应液的制备：将12.8mgDPPH试剂溶于甲醇溶液中，置于100mL容量瓶中，配成的母液为128mgL使用时稀释5倍至25.6mg/L(65M)并且现配现用。标准曲线制定：以美国Sigma-Aldrich公司的TrOIoX为标准品来测定标准曲线，标曲溶液配制方法：称取50.06mgTrolox用水定容之至100mL(2mM)0用蒸储水稀释成不同的浓度：0、200、400、600、800100
9、0和1200M。4.2.5抗癌细胞增殖活力研究4.2.5.1 细胞培养本论文采用的人乳腺癌MDA-MB-231细胞，由上海中科院细胞库提供。培养细胞所用的培养基由DMEM培养基、四季青胎牛血清、谷氨酰胺和双抗按照100：10：1：1的比例配制而成，生长在25cn?的细胞培养瓶中。然后将培养瓶放在条件设置为37、二氧化碳含量为5%培养箱中培养。每隔2到3天进行细胞换液或者传代，待细胞长到80%以上时，可以用于实验。4.2.5.2 MTT法测定多酚抗癌细胞的增殖能力选取生长状态良好的人乳腺癌细胞MDAMB231制成细胞悬浮液，根据每个孔的数量，以2x104/孔接种于96孔板中，每孔加入100L培养
10、液。每组进行三个平行实验。培养24h后，弃掉孔中培养液，用PBS轻轻清洗2遍后，用含有不同浓度等体积的红肉苹果酒多酚物质的生长培养基来处理细胞，加入的红肉苹果酒的多酚浓度范围为054mg/mLo孵化48h后弃掉培养液，添加100L无血清含有1mgmLMTT溶液的DMEM培养基。孵化4h后丢弃孔中溶液，更换为150LDMSO溶液，摇床震荡15min,使晶体溶解充分。用酶标仪测反应体系在490nm的吸光度。空白对照为不含细胞的培养基，对照组为无红肉苹果酒多酚处理含细胞的溶液。并计算细胞活力百分比和红肉苹果酒多酚对癌细胞的抑制率，细胞活力数()=(A样AA-A空白)/(A对照-A空白)l(X)%o4
11、.2.5.3 细胞周期的测定流式细胞仪检测细胞周期的分布参照Lietal.,(2013)中描述的方法进行，稍作修改，具体步骤如下:1)人体乳腺癌MDA-MB-231细胞经过2.251的常规培养后，按照2.252中步骤1-2中描述的方法进行菌悬液的制备和计数；2) 2mL的MDA-MB-231细胞以5X105细胞/孔的种植密度接种于6孔板;3)种好细胞的6孔板放在37C的5%CO2细胞培养箱中培养24h；4)将6孔板中的生长培养基弃除,用无菌PBS清洗两次后,分别用浓度为0,2000,3000Ug/mL的红肉苹果酒多酚的培养基处理细胞；5)在37C的5%CC)2培养箱中处理细胞24h后，收集处理
12、培养基备用，不含EDTA的胰酶消化，加入收集的处理培养基终止消化，100OXg离心5min,小心吸取上清，注意残留约50UL培养液，避免将细胞吸走；6加入ImL冰浴的PBS缓冲液清洗重悬细胞，转移到1.5mL的离心管中，1000g离心5min,小心吸取上清，可残留约50ULPBS,避免吸走细胞，用指尖轻轻弹击离心管底部，避免细胞成团；7)加入ImL冰浴的70%乙醇，轻轻吹打混匀，于4过夜固定，固定完后，I(M)OXg离心5min以沉淀细胞，小心吸取上清，可残留约50UL70%预冷的乙醇，避免吸走细胞；8加入ImL冰浴的PBS缓冲液清洗重悬细胞，再次IoooXg离心5min沉淀细胞，小心吸取上清
13、，可残留约50UL冰浴的PBS,避免吸走细胞，用指尖轻轻弹击离心管底部，避免细胞成团；9)参考表1,根据待检测样品的数量配制适量的碘化丙呢染色液，配制好的碘化丙咤染色液可在4。C短期保存，最好现配现用。表1碘化丙咤染色液的配制Table1Preparationofpropidiumiodidestainingsolution待测定样品个数612Numberoftestedsamples1染色缓冲液(mL)0.536碘化丙咤染色液(20X,L)25150300RNaseA(50,L)1060120终体积(mL)0.5353.216.4210)向每管中加入0.5mL碘化丙陡染色液，缓慢并且充分的悬
14、浮细胞沉淀,37避光孵育30min,随后置于冰上避光待测。11)细胞经过300目细胞筛过滤之后，用流式细胞仪进行检测和分析，检测条件为：激发波长488nm,用MOdFitLT3.1软件包(VeritySOftWareHOUSeInc.,Topsham,ME,USA)进行细胞DNA含量分析。所有的样品均进行3个独立的生物学重复，数据表示为平均值土标准差(meanSD)。4.2.5.4 流式细胞术检测细胞凋亡细胞凋亡用AnneXinV-FITC细胞凋亡试剂盒进行检测，其基本原理是细胞发生凋亡早期，会把磷脂酰丝氨酸外翻到细胞膜外侧，可被带有绿色荧光探针FITC标记的AnnexinV识别，而碘化丙咤(
15、ProPidiUmIodide,PI)可以染色坏死细胞或凋亡晚期的细胞。AnneXinV-FITC染色阳性并且Pl染色阴性(AnneXinV+/PI-)的细胞，即凋亡细胞，AnnexinV-FlTC和Pl染色双阳性(AnneXinV+PI+)的细胞，即坏死细胞。AnneXinV-FITC染色阴性Pl染色阳性(AnnexinVJPH)的细胞是许可范围内检测误差。实验操作参照生产制造商提供的说明书进行，并做适当调整。具体步骤如下：1)细胞处理参照4.253细胞周期的测定中步骤进行；2)在37C的5%CO2培养箱中处理细胞48h后，收集处理培养基备用，用不含EDTA的胰酶消化,加入收集的处理培养基终
16、止消化，100OXg离心5min,小心弃上清收集细胞，然后用PBS轻轻重悬细胞计数；3)取大约105个重悬细胞，100OXg离心7min,弃上清，加入195LAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞；4)向混合物中分别加入5ULAnnexinV-FFTC和IOULPI,并轻轻混匀；5)样品在室温下避光孵育20min,孵育过程中重悬细胞23次以确保染色效果，然后置于冰浴中避光待测；6)细胞经过300目细胞筛过滤之后，立即用BD-FACS-Arianl流式细胞仪(BektOn-DiCkinSon)进行分析。其中AnneXinV-FrrC是绿色荧光，Pl是红色荧光。数据用流式细胞仪自带软件进行分
17、析。所有的样品均进行3个独立的生物学重复，数据表示为平均值土标准差(meanSD)。4.3统计分析使用SPSSl6.0对所有数据进行统计学分析，红肉苹果酒样品之间的显著差异通过方差分析和DUnCan检验进行，模型在P0.05水平具有统计学意义。五、结果与分析5.1 标准曲线5.1.1 没食子酸标准曲线以没食子酸为标品绘制的标准曲线如图1,可得出线性回归方程y=3.275x+0.0037,其相关系数R2为0.9996。10rOooo。地我各y3275xOOO37R2-0 9996OQ11O0.060.12OlS0240.3浓度Concaitratioii(mgL)图1没食子酸标准曲线5.1.2
18、芦丁标准曲线以芦丁为标品绘制的标准曲线如图2,可得出线性回归方程y=0.8975x+0.0047,其相关系数R2为0.9998。y = 0897*047 Rj 0 9998图2芦丁标准曲线5.2 红肉苹果酒总酚、总类黄酮和总花青昔的含量代入吸光值可得出红肉苹果酒的总酚、总类黄酮和总花青苔的含量如表1所示。由表2可以看出，红肉苹果酒中所含的总酚和类黄酮含量最高，分别为600.24mgGAE/L和200.13mgREL0表2红肉苹果酒总酚、类黄酮、花青甘的含量苹果总酚类黄酮花青甘applecidersPhenolicsFlavonoidsAnthocyanins(mgGAE/L)(mgREL)(m
19、gC3GEL)Control600.24200.1372.045.3 抗氧化能力分析5.3.1 FRAP以Trolox为标品绘制的标准曲线如图3,可得出线性回归方程y=1.093x0.0095,其相关系数R2为0.9995O!Oo岑正多图3FRAP方法中的TrolOX标准曲线5.3.2 ABST自由基清除法以Trolox为标品制作的标准曲线如图4,可得出线性回归方程为y=-0.5991x0.9447,其相关系数R?为0.9990。09图4 ABTS方法中的TrolOX标准曲线 360 U一5.3.3 DPPH自由基清除法以Trolox为标品制作的标准曲线如图5示，可得出线性回归方程为y=-0.
20、05x+0.5457,其相关系数R2为0.9993。图5DPPH方法中的TrOloX标准曲线分别代入样品所测吸光值可得出所需实验数据如表3示，由表3可得，红肉苹果酒中的酚类物质的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和FRAP抗氧化能力分别为2758.6ImmOl/L,5108.54mmol/L#3405.69mmolL,可以看出红肉苹果酒中酚类物质清除ABTS自由基的能力高于DPPH自由基清除能力和FRAP抗氧化能力。表3不同抗氧化活性测定方法测定红肉苹果酒中的酚类物质样品DPPH uM TE/LABTS uM TE/LFRAP uM TE/LControl2758.615108.5
21、43405.695.4 红肉苹果酒中主要酚类成分分析对红肉苹果酒中单体酚含量进行了测定，结果如表4所示，由表4可以看出液相色谱法测得的各单体酚含量芦丁的含量最高，其次是绿原酸，再次是没食子酸。表4红肉苹果酒中的主要酚类成分分析红肉苹果酒中的主要酚类成分分析酚类组分PhenoliccomponentsControl原花青素B2ProcyanidinB23.51表儿茶素Epicatechin0.72芦丁Rutin20.18金丝桃昔Quercetin-3-galactoside1.47异棚皮昔Isoquercetin3.01番石榴昔Quercetin-3-arabinoside0.39根皮甘Phlo
22、rizin2.82棚皮素Quercetin10.71山奈酚Kaempferol0.12绿原酸ChIorogenicacid16.62肉桂酸Cinnamicacid0.31香豆素Couniarin1.28阿魏酸Ferulicacid丁香酸Syringate香兰酸3.342.615.3016.21Vanillicacid没食子酸图6红肉苹果酒中的主要酚类成分液相色谱图5.6红肉苹果酒多酚抗癌细胞增殖活性分析5.6.2 多酚抗癌细胞的增殖能力分析MTT法测定了50,100,200、400、800、1000、2000、4000g/mL的红肉苹果酒多酚处理细胞后，从图7可知，横坐标为红肉苹果酒多酚浓度，
23、纵坐标为细胞增殖活力。随着多酚浓度的提高,细胞增殖能力不断的降低。从图8可以看出，横坐标为红肉苹果酒多酚的浓度，纵坐标为细胞抑制率，随着多酚浓度的提高,细胞抑制率不断提高。T 一可EZ*O2打肉羊果,名足派Mm图8红肉苹果酒多酚浓度对MDA-MB-231细胞的抑制率5.6.3 流式细胞术分析红肉苹果酒多酚对细胞周期的影响为了评估红肉苹果酒多酚能否引起MDA-MB-231细胞周期阻滞,我们用流式细胞术检测了3000.2000.0Ug/mL的红肉苹果酒多酚处理细胞24h后的(图9-ll)0由图可知，与对照组相比，3000和2000ugmL的红肉苹果酒多酚处理增加了G0/G1细胞的积累。与对照组(5
24、7.29%)相比,3000ugmL和2000ugmL红肉苹果酒多酚对G0/G1的累积量分别增加到76.01%和67.46%。同时，S期细胞比例下降,3000ugmL和2000111_红肉苹果酒多酚分别使5期细胞比例从34.71%下降到15.99%和24.54%。这些结果表明苹果酒多酚均通过诱导Gl期阻滞来抑制MDA-MB-231细胞生长,且呈剂量依赖性。图93000ug/ml红肉苹果酒多酚处理5.6.4 AnnexinVPl双染技术对不同浓度红肉苹果酒多酚处理的细胞调亡特征分析为了确定红肉苹果酒多酚能否通过诱导细胞凋亡引起MDAMB231细胞的死亡，用AnnexinVPI双染技术分别对2000
25、Ug/ml和3000Ug/ml红肉苹果酒多酚处理的细胞调亡特征进行了分析。结果如图9-11所示，四个象限呈现不同的情况,Ql代表操作所造成的允许误差,Q2为晚期凋亡或已经坏死的细胞,Q3代表正常的细胞，Q4代表早期调亡的细胞。与对照组相比，高浓度和低浓度的红肉苹果酒多酚均能造成MDA-MB-231细胞调亡。2000Ug/ml和3000g/ml的红肉苹果酒多酚分别可以诱导50.8%和66.0%的晚期调亡或坏死细胞凋亡，结果表明，红肉苹果酒多酚均能诱导细胞凋亡。图 12 Control图13 3000 gml红肉苹果酒多酚处理o-zVco图142000g/ml红肉苹果酒多酚处理六、结论本研究表明，
26、红肉苹果酒多酚具有较高含量的酚类物质及抗氧化能力。MTT法分析红肉苹果酒多酚对乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制效果表明，红肉苹果酒多酚对乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制效果良好。参考文献：Zuo,W.E,Zhang,T.L.,Xu,H.E,Wang,C.,Lu,M.S.,ChenX.S.Effectoffermentationtimeonnutritionalcomponentsofred-fleshedapplecider.FoodandBioproductsProcessing.2018,114:276-285.李翠霞.红肉苹果新品种多酚组分，生物活性及酿酒适应性分析D.山东农业大
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