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1、应用生物化学 第一章,生化物质（生命大分子物质）通常是指动物、植物和微生物在进行生长发育、新陈代谢时，所形成的蛋白质（包括酶）和核酸等有机化合物的总称。,第一章:生化物质的制备,生化物质的特点：1、生化物质组成非常复杂。其中包括数百种甚至数千种化合物，并且在分离过程中，这些化合物仍在发生代谢变化，如 蛋白质和核酸的水解。2、有些化合物的含量极微，如激素等。3、许多具有生物活性的物质一旦离开活体，很易变性破坏，因此常选用比较温和的条件进行制备。,第一节 生物材料的选择,（一）选择生物材料的原则：有效成分含量多，稳定性好；来源丰富，保持新鲜；提取方法简单；有综合利用价值等。（二）生物材料一般可以分
2、为两大类：天然生物材料 人工生物材料,天然生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物含量较高的生物个体、器官或组织。人工生物材料又分为三种：1、新品种材料 2、组织培养材料 3、生物产品与生物制品材料,（三）蛋白质原料的选择,如何提高制备天然蛋白质的品质、产量和降低成本？种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞,1种属,猪胰脏中 单位含量3000 IUkg牛胰脏中 单位含量4000 IUkg 抗原性方面猪胰岛素比牛胰岛素低，前者与人胰岛素相比，只有1个氨基酸的差异，而牛有3个氨基酸的差异。,胰岛素（isulin),PK,2发育阶段,幼年动物的胸腺比较发达，老龄后逐渐萎
3、缩，因此胸腺原料必须采自幼龄动物。,胸腺（thyums）胸腺素调节免疫功能,3生物状态,动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分泌使胆汁排空，对胆汁的收集不利。,4原料来源,血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取，两者生物学功能并无二致，而稳定性以颚下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶。,5原料解剖学部位,猪胰脏中，胰尾部分含激素较多，而胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则可提高各产品的收率。,胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白酶(pepsin)则以采取胃底部粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化酶。,6.从简化提纯步骤着手,如从鸽肝中提取乙酰化酶，需将动物饥饿后取材，可减
4、少肝糖原，以简化纯化步骤。,7对生物技术产品宿主菌或细胞的要求,选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处理的问题。大肠杆菌表达；（分泌，毒素）枯草杆菌或酵母菌表达；（糖基化）动物细胞和昆虫细胞表达,第二节 细胞及组织的破碎,细胞及组织破碎的方法多种多样，根据实验目的和材料的不同可以采用不同的细胞破碎方法：（一）机械方法：主要通过机械力的作用，使组织粉碎。粉碎少量原料时，可使用高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。工业生产上一般常用的粉碎设备有电磨机、球磨机、万能粉碎机、击碎机等。,（二）物理方法,1.反复冻融法,把待破碎的样品冷至1520，使之凝固，然后缓慢地溶解，如此反复操作，大部分组织细
5、胞及细胞内的颗粒可以破碎。也常采用液氮（-196）反复冻融法。,在细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。操作时，将材料投入沸水中，在90左右维持数分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。,2.冷热交替法,3超声波处理法,多用于微生物材料，处理的效果与样品浓度、使用频率有关。操作中注意避免溶液中气泡的存在，制备对超声波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。,4.加压破碎法,加气压或水压（如高压匀质机），达20.5934.32MPa的压力时，可使90%以上细胞被压碎。（1.013105 Pa10.336m水柱）多用于微生物酶制剂的工业制备。,（三）生化及化学方法,1.自溶法 即新鲜的生
6、物材料存放在一定的pH和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料选在04，微生物材料则多在室温下进行。,自溶时，需加少量的防腐剂，如甲苯、氯仿等，以防止外界细菌的污染。因自溶的时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸、蛋白质时比较少用。,2酶处理法,用外来酶处理生物材料：溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的酶；蜗牛酶用于酵母细胞的破碎；用于专一性分解细胞壁的酶还有纤维素酶（破坏植物细胞）、细菌蛋白酶、酯酶、壳糖酶等。,3.表面活性剂处理法,表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、增溶作用。较常用的有十二烷
7、基硫酸钠(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。,第三节 生物分子的提取,提取：是在分离纯化前期，把破碎的组织或细胞置于一定的溶剂（提取液）中，利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异，从混合物中分离出一种或几种组分的过程称为提取，提取又称萃取或抽提。提取液应具备的条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质溶解度小或不溶解；来源广泛、价格低廉、操作安全等。,生物分子可以分为：生物大分子和生物小分子 生物小分子的结构由较强的共价键决定；生物大分子中除共价键外，还含有较弱的共价键和次级键，故需温和的条件才能保证生物大分子的活性不被破坏。,溶剂提取法,原理:利用溶剂的溶解作用把所需物质从细胞中转移出
8、来。影响溶剂提取效率的因素：1.溶剂的性质：根据相似相溶原理2.离子强度：离子强度是影响物质溶解度的主要因素，但离子强度对不同物质溶解度的影响不同，如高离子强度下DNA-核蛋白溶解度增加，而低离子强度下RNA-核蛋白溶解度增加；绝大多数蛋白质和酶，在稀盐溶液中溶解度增加（盐溶）。,分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子离散，溶入水中。,3.PH值：溶剂的PH值影响溶质分子的解离状态，离子状态的物质，无论阳离子还是阴离子都易溶于水，而非离子状态的物质易溶于有机溶剂。4.温度：不同温度的可以改变物质的溶解度。5.去垢剂：去垢剂是一类既有亲水基又有疏水基的物质
9、，可以分为阴离子、阳离子和中性去垢剂等，如SDS，Tween20，Triton X-100。,第四节：生物大分子的浓缩,1、沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂，使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤收集的沉淀物。盐析法；等电点沉淀法；有机溶剂沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀法；酸碱变性沉淀法等。,2、吸附法：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右。3、超过滤法：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。4、透析浓缩法5、减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压蒸馏装置中，在减压真空状态下进行蒸
10、馏。6、冰冻干燥法,浓缩实例,（一）、硫酸氨盐析法1.原理：根据蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随着盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出，盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。,蛋白质分子表面的疏水性区域都聚集许多水分子，当盐类加入时这些水分子被抽出，以便与盐离子进行水合，暴露出来的疏水性区域相互结合形成沉淀。,2、影响蛋白质盐析的因素（）蛋白质浓度对盐析的影响：蛋白质浓度过大，盐析时发生共沉现象，分离效果不好；蛋白质浓度太稀，耗盐
11、量过大，蛋白质回收率也低。一般为2.5%-3.0%的蛋白质浓度较适中。（）离子强度和离子类型对盐析的影响：离子强度越大，蛋白质的溶解度越低，越容易产生盐析现象；离子半径小而价数高的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而价数低的离子对盐析影响弱。,（）对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，溶解度越大；在净电荷为零时，溶解度最低。一般将值调到蛋白质等电点附近，这样有利于盐析。,（二）、有机溶剂沉淀法,1、原理：有机溶剂对许多溶于水的小分子生化物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。对于具有表面水层的生物大分子来说，有机溶剂可破坏溶质分子表面的水膜，使这些大分子脱水而相互聚集析出。不同溶
12、质要求不同浓度的有机溶剂，因此可用有机溶剂进行分步沉淀。,有机溶剂,2、优点：有机溶剂沉淀法分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱盐，过滤比较容易。3、缺点：对某些具有生物活性的大分子，容易引起变性失活，操作常在低温下进行；分离效果差，共沉作用大；离子强度及离子种类对其也有影响。,（三）、透析浓缩法,1、原理：天然或人工半透膜只允许小分子通过而阻碍大分子通过。当膜的两侧存在小分子浓度梯度差时，小分子就从高浓度一侧向低浓度一侧扩散，直至达到平衡，如果能不断去除扩散出来的小分子，从而达到分离纯化的目的。,2、影响透析的因素 1、半透膜的通透性：半透膜的通透性取决于膜孔径的大小，在能阻碍大分子扩散的前提下，孔径越大，透析速度越快。2、透析外液的更换 3、温度：温度越高，透析速度越快。4、压力：用跨膜的压力梯度可加速大分子的分离速度。,（四）、等电点沉淀法,原理：利用两性电解质在等电点处溶解度最小的性质。不同的两性电解质其等电点不同，其在电中性时溶解度不相同。因而等电点沉淀法可用于某些两性电解质的分离如氨基酸、蛋白质、核苷酸等。为了增加沉淀效果，往往在等电点时再加上其他沉淀因素，所以等电点沉淀法一般不单独使用，常和盐析法、有机溶剂沉淀法一起使用，以提高其沉淀能力。,
