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1、自身免疫抗体检测及临床意义,电力医院：马林,抗核抗体（ANA）检测与临床应用,ANA的靶抗原分布：,细胞核,整个细胞，包括细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期蛋白等。ENA：抗可提取核抗原，包括RNP/Sm,Sm,SS-A,SS-B,Scl-70和Jo-1等六种靶抗原,抗核抗体的定义传统定义：针对细胞核成分的自身抗体的总称。广义定义：针对细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。对ANA的理解不再局限于核成分，而是指核酸和核蛋白抗体的总称,ANA可见于多种疾病，特别是结缔组织疾病，常作为结缔组织病的诊断、,病情判断和疗效观察的指标,高滴度ANA则高度提示自身免疫性疾病,在非结缔组织病中也可出现阳性
2、；正常人中（特别是老年人）也可出现阳,性，但滴度低,目前，ANA检测已成为临床上的一个极重要的自身免疫病的筛查实验。,ANA检测的临床意义,ANA检测的临床意义系统性红斑狼疮,活动期非活动期药物诱导的红斑狼疮混合性结缔组织病（MCTD、Sharp综合征）类风湿性关节炎进行性系统性硬化症多发性肌炎及皮肌炎干燥综合征慢性活动性肝炎溃疡性结肠炎其它风湿病正常人,9510080100100100204020508595305070803040265-10,美国风湿学会(ACR)立场声明,HEp-2 细胞包含大约100 至150 种自身抗原 其它初筛方法仅具有少量自身抗原,大约 35%SLE患者和IFT
3、-ANA阳性患者在其它初筛实验中为阴性结果,建议：,IIFT-ANA仍然为ANA检测的金标准,医院或商业诊断所应用其它ANA检测方法时，必须要求为临床大夫提供足够的数据证明其它ANA检测方法与IFT比较具有同样或更高的敏感度和特异性 实验室在ANA报告当中必须注明ANA检测方法,EUROIMMUN,ANA筛查:,间接免疫荧光法(IFT),抗原谱完整(细胞核、细胞浆),检测ANA的金标准，具有很高的敏感性和特异性 基质组合:HEp-2细胞+灵长类肝,HEp-2细胞:筛查不同的自身抗体,均质型核膜型,核点型核糖体P蛋白,着丝点型AMA,核仁型高尔基体,Scl-70溶酶体,Sm/RNP肌动蛋白,SS
4、-A/SS-B波形蛋白,系统性红斑狼疮(SLE),ANCA 相关性血管炎,慢性炎症性结缔组织病(CICTD)干燥综合征(SS),Systemischer LupusErythematodes(SLE)dsDNA系统性硬化症(SSc)Scl-70 and CenpB,SS-A and SS-B慢性炎症性结缔组织病(CICTD)多肌炎/皮肌炎(PM/DM)Myositis Profile,夏普综合征(MCTD)RNPRheumatoideArthritis(RA)EUROIMMUN,系统性红斑狼疮(SLE),红斑狼疮的特点,临床医生:容易误诊的一类致死性疾病,免疫学家:所有免疫系统的要件均参与致病
5、机理产生过程,临床发病特点,发病率:40/100,000(北欧);200/100,000(黑人);250,000(美国),患者寿命:4年/50%(1950);15/80%(当前);20岁诊断/35岁死亡几率1:6,以上受累;96%),EUROIMMUN,SLE 各器官的表现,关节炎(至少2个关节,血液系统受累(贫血等;60%),狼疮肾炎(51%),浆膜炎(胸膜炎,心包炎;77%),神经系统受累(30%)皮肤(蝴蝶状皮疹,盘状狼疮;74%),系统性红斑狼疮(SLE)代表性的抗体,抗 dsDNA 抗体抗核小体抗体抗 Sm 抗体抗核糖体 P 蛋白抗体,30-90%50-95%5-10%5-15%EU
6、ROIMMUN,EUROIMMUN,核均质型HEp-2细胞/猴肝,HEp-2细胞,猴肝,抗dsDNA 抗体-检测方法:IIFT,Farr-法(RIA),ELISA or BlotIIFT dsDNA,HEp-2细胞,绿蝇短膜虫,高度特异性抗体;,70%患者阳性，0.5%正常人或RA患者阳性,滴度与疾病活动性相关，但不适用于所有患者,抗体滴度上升但临床症状不明显的患者，抗体检测后5年内,80%患者进入活动期,抗dsDNA抗体与SLE,最新版“Autoantibodies”描述,不同实验方法的结果并无可比性：,1、抗原来源不同；,2、抗原展现形式不同；,3、实验体系反应条件不同。,核均质:,抗核小
7、体抗体(ANuA),靶抗原:,dsDNA-组蛋白-复合物的构象决定簇,方法:,IIFA,ELISA,Blot,临床意义:,SLE,阳性率 50-95%(特异性100%),EUROIMMUN,抗核小体 ELISA:敏感性、特异性、疾病活动度,ANuA 与疾病的活动性相关性强(SLE DAI score),分组SLE干燥综合症皮肌炎/多肌炎系统性硬化症类风湿/骨关节炎强直性脊柱炎健康对照组特异性,n233414033602031225,抗核小体阳性144(61.8%)1(2.4%)1(2.5%)1(3.0%)1(1.7%)0098.2%,Su et al.,Clin Immunol 122:115
8、-120,2007,LNTP(%),LN(%),CON(%),ANuAAnti-dsDNA,7943,1841,933,LNTP=lupus nephritis requiring renal transplantation（狼疮肾炎需要肾移植）LN=biopsy proven lupus nephritis（肾活检确诊为狼疮肾炎）CON=SLE patients without nephritis（无肾炎SLE患者）,伴有狼疮肾炎的严重SLE的生物标记物,ANuA 与狼疮性肾炎Stinton et al.,Lupus 15:394-400,2007 狼疮肾炎是SLE的一种潜在的严重并发症(高
9、达 50%)1.2%需要进行肾移植的患者有狼疮肾炎,EUROIMMUN,抗U1-nRNP与Sm抗体,HEp-2细胞,猴肝,HEp-2细胞,抗U1-nRNP与Sm抗体抗U1-nRNP/Sm抗体抗Sm抗体SLE抗U1-nRNP抗体SLESharp综合征,(MCTD)EUROIMMUN,抗U1-nRNP与Sm抗体,SLE:15-40%MCTD:95-100%SLE:5-30%EUROIMMUN,抗U1-RNP抗体抗Sm抗体Function:Pre-mRNA splicing,EUROLINE,ANA 谱,最多18种抗原，增加了RNP亚单位,自动化 操作,全自动化 结果判读,EUROIMMUN,实验结
10、果的解释（ANA谱）：抗U1-nRNP/Sm和Sm抗体,抗 nRNP/Sm抗体,抗 Sm 抗体,结果,解释,-?+,-+-,-+-+,U1-nRNP:Sm:-U1-nRNP:Sm:+U1-nRNP:Sm:-结果不可靠,阴性SLESLE 或 MCTD无,EUROIMMUN,抗核糖体P蛋白抗体,HEp-2细胞,猴肝,40 S亚单位,60 S亚单位,P0,P2 P2,according to:Mahler et al.,J Mol Med,2003,抗原:,核糖体60S亚单位的3个蛋白：P0,P1,P2.在羧基末端有相同的免疫反应表位。核糖体P抗原的五聚体复合物。P1 P1,核糖体 P蛋白,核糖体
11、P 蛋白 ELISA:敏感性和特异性(1),群组SLE其他结缔组织病*健康献血员,n36079206,抗核糖体 P 蛋白阳性数34(9.4%)0%0%,*系统性硬化症,干燥综合症,皮肌炎/多肌炎 对 SLE 100%特异EUROIMMUN,核糖体 P 蛋白 ELISA:敏感性和特异性(2),群组SLEMCTDSSSScRAHD特异性,n18521556689100310,抗核糖体P蛋白阳性数10(5.4%)00000100%EUROIMMUN,EUROIMMUN,HEp-2细胞,增殖型细胞核抗原(PCNA)Hep-2细胞,猴肝,增殖型细胞核抗原(PCNA),靶抗原:,表达为细胞周期依赖性(S-
12、期),三聚体(36 kDa)，是 DNA 多聚酶的辅因子并参与 DNA 修复调控,检测:,IIFT,Blot,临床意义:,SLE高特异性(阳性率 3-7%),与肾脏和CNS及血小板减少相关,系统性红斑狼疮(SLE),ANCA 相关性血管炎,慢性炎症性结缔组织病(CICTD)干燥综合症(SS),Systemischer LupusErythematodes(SLE)dsDNA系统性硬化症(SSc)Scl-70 and CenpB,SS-A and SS-B慢性炎症性结缔组织病(CICTD)多肌炎/皮肌炎(PM/DM)Myositis Profile,夏普综合症(MCTD)RNPRheumatoi
13、deArthritis(RA)EUROIMMUN,干燥综合征（Sjgrens Syndrome）外分泌腺受累的自身免疫疾病 症状:-口腔干燥-唾液及眼泪减少,-腮腺肿胀,口腔干燥,-胰腺外分泌腺分泌不足腮腺肿胀EUROIMMUN,干燥综合征,SS-A(60 kDa)SS-B(47 kDa),40-95%40-95%,代表性抗体,EUROIMMUN,抗SS-A/SS-B抗体,HEp-2细胞,猴肝,SS-A 抗原,Boire et al.,1995:-Ro-52抗体不与SS-A 抗原结合,-纯化的 SS-A 抗原不包含 Ro-52,RNA+SS-A(60 kDa)+Ro-52hY-RNA,RNA+
14、SS-A(60 kDa)hY-RNA,SS-A(Ro-60),Ro-52 and SS-B,干燥综合症:,40-95%,SLE:,20-60%,新生儿狼疮:,抗SS-B抗体,干燥综合症:SLE:新生儿狼疮:,40-95%10-20%78%,抗Ro-52(52 kDa)抗体非特异EUROIMMUN,功能:调控RNA翻译抗SS-A(60 kDa)抗体,功能:RNA聚合酶III辅助蛋白,96%X,EUROIMMUN,抗Ro-52抗体:,不同组别中均可出现,抗Ro-52抗体:风湿性疾病中的阳性率,疾病干燥综合症系统性硬化症肌炎SLEMCTDRA,n88812621021165,抗Ro-52抗体阳性81
15、%28%31%38%19%5%,抗Ro-52抗体 在干燥综合症中阳性率较高，但没有疾病特异性Meyer,Schlumberger et al.,4th Asian Congress on Autoimmunity,Singapore,Sept.2009EUROIMMUN,Anti-Ro52:肝脏疾病中的阳性率,疾病PBCAIHHBVHCV献血员,n10060505050,抗Ro-52抗体 阳性27%35%10%22%0,抗Ro-52抗体没有疾病特异性Meyer,Schlumberger et al.,4th Asian Congress on Autoimmunity,Singapore,Se
16、pt.2009,系统性红斑狼疮(SLE),ANCA 相关性血管炎,慢性炎症性结缔组织病(CICTD)干燥综合症(SS),Systemischer LupusErythematodes(SLE)dsDNA系统性硬化症(SSc)Scl-70 and CenpB,SS-A and SS-B慢性炎症性结缔组织病(CICTD)多肌炎/皮肌炎(PM/DM)Myositis Profile,夏普综合症(MCTD)RNPRheumatoideArthritis(RA)EUROIMMUN,系统性硬化症(SSc)血管与结缔组织受累的自身免疫疾病 症状:-指端硬化(thin,sclerotic fingers)-爪
17、型手-面具脸(嘴周边出现皱纹,嘴唇变薄)-毛细血管扩张(表面血管永久性扩张)-表皮钙质沉着(血管壁与皮肤钙化),指端硬化，爪型手,毛细血管扩张,面具脸,EUROIMMUN 质沉着,皮肤钙,EUROIMMUN,系统性硬化症,实验室结果和临床数据的联合分析，有助于降低疾病诊断的模糊性，同时为未来研究硬化症提供基础。,系统性硬化症(SSc)代表性抗体,抗着丝点抗体抗Scl-70抗体抗原纤维蛋白抗体抗RNA多聚酶抗体抗PM-Scl抗体,12-43%18-30%6-8%2-23%1-16%EUROIMMUN,EUROIMMUN,抗着丝点抗体HEp-2细胞/猴肝,HEp-2细胞,猴肝,EUROIMMUN,
18、抗着丝点抗体,靶抗原:,着丝点-DNA 联合蛋白:着丝点蛋白(A,B,C,D),检测方法:,IIFT,ELISA,Blot,临床意义:,局限性 硬皮病(CREST综合症):,经常出现在:硬皮病-PBC-重叠综合症,EUROIMMUN,抗Scl-70抗体HEp-2细胞/猴肝,HEp-2细胞,猴肝,细胞核仁:,抗Scl-70抗体,靶抗原:,DNA-拓扑异构酶 I(100 kDa)DNA 双螺旋复制和转录,检测方法:,IIFA,ELISA,Blot,临床意义:,弥散性硬皮病的诊断标志(50-75%).,预后:较着丝点阳性的患者病情更严重。,抗着丝点B蛋白抗体与 抗Scl-70抗体,系统性硬化症n=2
19、95,抗 Scl-70 抗体阳性 阴性,抗着丝点 B蛋白抗体,阳性阴性,166,106122,59%系统性硬化症患者分别出现抗着丝点抗体或抗Scl-70抗体阳性EUROIMMUN,EUROIMMUN,抗RNA聚合酶I抗体HEp-2细胞/猴肝,HEp-2细胞,猴肝,抗原纤维蛋白抗体HEp-2细胞/猴肝,HEp-2细胞,猴肝EUROIMMUN,EUROIMMUN,抗PM-Scl抗体HEp-2细胞/猴肝,HEp-2细胞,猴肝,抗PM-Scl抗体,靶抗原:,PM-Scl:11 到 16 个多肽复合物,在rRNA 和一些 U-snRNAs剪接中起作用,(PM-Scl-100,PM-Scl-75),检测方
20、法:,IIFT,ELISA,Blot,临床意义:,重叠综合症的诊断标志，表现为肌炎和硬皮病症状(阳性率 50-70%).,EUROLINE,系统性硬化症谱,一个实验膜条包括13 种高特异性纯化抗原,系统性硬化症(SSc)血清学诊断,EUROBlotMaster自动化操作,EUROLineScan软件全自动结果判读,患者血清:129 份SSc血清和202 份对照血清 50 PM/DM,50 SLE,42 RA,60,HD,所有抗原的血清命中率为:85.3%.,系统性硬化症相关抗体,Meyer et al.,7th Congress on Autoimmunity in Ljubljana,May
21、 2010,Arthritis Research&Therapy(in press).,相关参考资料Antibodies against PM/Scl-75 and PM/Scl-100 areindependent markers for different subsets of systemicsclerosis patients.K.Hanke,C.Brckner,C.Dhnrich,D.Huscher,L.Komorowski,W.Meyer,A.Janssen,M.Backhaus,M.Becker,A.Kill,K.Egerer,G.R.Burmester,F.Hiepe,W.Sc
22、hlumbergerand G.RiemekastenArthritis Research&Therapy,2009:11Diagnostic value of anti-topoisomerase I antibodies in a large monocentric cohort.Hanke K,Dhnrich C,Brckner CS,Huscher D,Becker M,Jansen A,Meyer W,Egerer K,Hiepe F,Burmester G,Schlumberger W,Riemekasten G.,系统性红斑狼疮(SLE),ANCA 相关性血管炎,慢性炎症性结缔组
23、织病(CICTD)干燥综合症(SS),Systemischer LupusErythematodes(SLE)dsDNA系统性硬化症(SSc)Scl-70 and CenpB,SS-A and SS-B慢性炎症性结缔组织病(CICTD)多肌炎/皮肌炎(PM/DM)Myositis Profile,夏普综合症(MCTD)RNPRheumatoideArthritis(RA)EUROIMMUN,-皮肤症状:,-红斑-膝盖/手指关节处皮肤异变-皮肤褪色,多肌炎/皮肌炎(PM/DM)皮肤与肌肉受累的自身免疫疾病 症状:-肌肉疼痛/肌无力(如：肩膀/骨盆),多肌炎/皮肌炎(PM/DM)代表性抗体,Jo-
24、1Mi-2(esp.in DM)PM-Scl(PSS-重叠综合征)PL-7PL-12,25-35%15-30%8%3-6%3%,EUROIMMUN,抗Jo-1抗体HEp-2细胞/猴肝,HEp-2细胞,猴肝,胞浆颗粒:抗Jo-1抗体,靶抗原:,Jo-1(组胺酰-tRNA 合成酶),检测方法:,IIFA,ELISA,Blot,临床意义:,对多肌炎具有高度特异性(阳性率 25-35%),Jo-1:病情严重的标志。常与肺纤维化有关(70%),EUROIMMUN,氨酰基-tRNA-合成酶,氨酰基-,tRNA,合成酶,Jo-1:组氨酰l-tRNA合成酶,PL-7:苏氨酰基-tRNA合成酶,PL-12:丙氨
25、酰-tRNA,合成酶,OJ:异亮氨酸-tRNA合成酶,EJ:甘氨酰-tRNA合成酶,EUROIMMUN,抗Mi-2抗体HEp-2细胞/猴肝,HEp-2细胞,猴肝,细胞核颗粒:Anti-Mi-2,靶抗原:,多组分系统;,与组蛋白乙酰基转移酶和核小体重塑活性有关的主要抗原(218kDa),临床意义:,肌炎 5-15%(主要是皮肌炎),EUROIMMUN,抗Ku抗体HEp-2细胞/猴肝,HEp-2细胞,猴肝,细胞核颗粒:,抗Ku抗体(p70/p80),靶抗原:,DNA结合的非组蛋白和DNA依赖的蛋白酶异源二聚体,分析方法:,IIFA,Blot,临床意义:,PM/Scl-重叠综合症 30-55%,SL
26、E 5-10%,EUROIMMUN,其他与肌炎相关的抗体,Anti-SRP,Anti-PL-12,HEp-2细胞,HEp-2细胞,EUROLINE 肌炎相关抗原,一个膜条上包括7 或 11 种高度纯化抗原(新:PM-,Scl,SRP,EJ,OJ),DM 和 PM及原发性肌炎的血清学诊断,EUROBlotMaster 自动化操作,EUROLineScan全自动化判读结果,153 份肌炎患者血清 50 DM,89 PM,4 juvenile DM,10 IBM 77 份对照血清 26 SjS,26 SLE,25 SSc,Anti-Mi-2KuPM-Scl100Jo-1PL-7PL-12SRP,Pr
27、evalence3%3%7%12%2%0%5%,Specificity100%97%100%99%100%100%97%,EUROLINE 肌炎相关抗原患者血清:,所有抗原的血清学命中率:26%.Rnnelid et al.,Autoimmun Rev,2009EUROIMMUN,患者血清:208 份肌炎患者血清,214 份对照血清 50 HD,65 SLE,34 SSc,21 SjS,13 非自身免疫性肌病,23 CTD-相关性肌炎,8 关节病,Anti-,Prevalence Specificity,Mi-2KuPM-Scl100Jo-1PL-7 or PL-12,4%5%4%21%4%,
28、98%95%100%100%100%,EUROLINE肌炎相关抗原,所有抗原的血清学命中率:37%.Ghirardello et al.,Autoimmun Rev,2009EUROIMMUN,Use of a commercial line blot assay as a screeningtest for autoantibodies in inflammatory myopathies,J.Rnnelid,S.Barbasso Helmers,H.Storfors,K.Grip,L.Rnnblom,K.Franck-Larsson,G.Nordmark,I.E.Lundberg,Auto
29、immunity Reviews 2009 Mar 11,相关参考资料,其他疾病中的抗核抗体,EUROIMMUN,抗线粒体抗体(AMA)HEp-2细胞/猴肝,HEp-2细胞,猴肝,胞浆粗颗粒:抗线粒体抗体(AMA),靶抗原:,M1 M9:M2(丙酮酸脱氢酶),M4(亚硫酸氧化酶),M9(糖原磷酸化酶 a).,分析方法:,IIFA,ELISA,Blot,临床意义:,PBC 患者出现抗体 M2,M4,M9M2:PBC标志性抗体(阳性率 95%)M4:阳性率较低或总伴有M2阳性M9:PBC早期出现(82%),核颗粒型,胞浆纤维型：波形蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白等,分裂期细胞阳性：纺垂体、中间体、中心粒等,细胞核,细胞浆,核糖核蛋白：Sm、nRNP、SS-A、SS-BKu,细胞周期蛋白：I型（PCNA）和II型ANA核仁型：Scl-70、RNA多聚酶、PM-Scl和原纤维蛋白等核浆点型：着丝点、核点等胞浆颗粒型：线粒体、Jo-1、核糖体等,抗核抗体谱的分类根据产生的荧光模型、靶抗原的分布部位分类如下：核均质型：DNA、组蛋白和核小体等核膜型：板层素、gp210等,谢谢,电力医院马林,
