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1、糖皮质激素及其受体在细胞数量稳态方面的调节作用及机制,研究结果表明，糖皮质激素（glucocorticoids,GC）一方面能够抑制体内多种细胞的增殖，另一方面还对多种凋亡诱导因子导致的细胞凋亡具有拮抗作用。因此，认为GC能通过上述作用来保持细胞数量的稳定，这种对细胞数量的稳态调节可能是GC对机体稳态调节的一个重要方面。本次课主要讲授糖皮质激素/受体抑制细胞增殖和抗细胞凋亡的作用及其作用机制。这方面的研究有助于充分了解GC的生理和药理作用以及副作用产生的机制，同时对我们同学做一些较深入的新药研究工作可能会有一定的启发。,细胞对一些体内外刺激（缺氧、炎症、基因毒物质、活性氧、血液中某些神经内分泌
2、激素浓度的过度增高等）的反应取决于刺激的强度和细胞本身所处的状态。适度的刺激可以通过激活细胞内信号转导途径导致细胞的增殖反应，而过强的有害刺激则可诱导细胞凋亡或导致细胞坏死。,因此,体内必然存在着维持细胞数量稳态的调控机制。该机制一方面可以防止细胞过度增殖而导致的细胞数量异常增多（肿瘤发生的基础），另一方面还可以保护细胞免于各种有害刺激所致的细胞凋亡或坏死。,维持细胞数量的稳态对于有机体的生长发育、组织器官功能的维持以及防止肿瘤等疾病的发生发展具有重要意义。糖皮质激素（GC）是调节机体生长发育以及维持机体稳态的重要激素，该激素和其受体（GR）在保持细胞数量的稳态方面具有重要作用.,一、GC/G
3、R抑制细胞增殖和抗凋亡的作用,GC能够抑制胸腺细胞、淋巴细胞和白血病细胞的增殖（后来证实GC还能诱导这些细胞凋亡），因此，GC被临床广泛用于抗炎，治疗自身免疫性疾病和淋巴细胞性肿瘤。GC还能抑制成纤维细胞、成骨细胞的增殖，这是临床长时间应用GC后导致皮肤萎缩、伤口愈合障碍、骨质疏松、甚至股骨头坏死（如在SARS治疗中出现的情况）的重要原因。,GC还能抑制上皮细胞（如胃上皮细胞）及多种上皮来源的肿瘤细胞（如肺癌细胞、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等）的增殖，这种作用是通过受体介导的。除了能抑制多种细胞的增殖外，GC对细胞凋亡同样具有重要的调节作用。如GC可诱导淋巴细胞、白血病细胞、多种骨髓瘤细胞凋亡.
4、,但对另一些细胞却有抗凋亡作用。如在神经细胞、心肌细胞、中性粒细胞、原代培养的肝细胞、肺上皮细胞以及卵巢卵泡细胞中，GC能拮抗有害刺激如去除血清或生长因子、缺氧、缺血/再灌、TNF-等诱导的细胞凋亡。有报道在乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞以及神经纤维肉瘤细胞等肿瘤细胞中，由于放射线、抗癌药顺铂、卡铂等诱导的细胞凋亡也能被GC明显抑制。,人工合成的GC地塞米松（Dex）能抑制人卵巢癌细胞系（HO-8910）以及骨肉瘤HOS-8603细胞的增殖.观察Dex与顺铂联用对卵巢癌HO-8910细胞的作用:发现Dex单用可以抑制细胞增殖（25-30%），但是与化疗药物顺铂联用时，却可以明显
5、降低顺铂诱导该细胞凋亡的作用（细胞凋亡从70%降至30%）。由于GC/GR在同一细胞中既能抑制细胞增殖，又具有抗凋亡的作用，这就强烈提示Dex对细胞数量的调控并非单向的。,Dex对多种上皮来源的肿瘤细胞的数量调节可能是一种稳态调节。它能使上皮来源的肿瘤细胞在多种刺激因素的作用下既不会过度增殖，也不因出现凋亡诱导因素而导致细胞数量的过度减少。GC/GR对细胞数量的稳态调节不仅与GC的生理作用（如调节生长发育，维持內环境稳定等）有关，还与GC的药理作用及其副作用（生长障碍、伤口愈合缓慢、骨质疏松、肌肉萎缩等）有关。因此，研究GC/GR对细胞数量稳态的调节作用及其作用机制是非常必要的。,GC对机体的
6、作用广泛而复杂，除了其受体介导的对基因表达的调节作用外，近年来的研究已证明GC还有非基因组（nongenomic action）作用，而GR也可能有配体非依赖性的作用。GC可以通过多种复杂机制影响在细胞增殖和细胞凋亡通路中起关键作用的效应分子以及上游的信号转导蛋白和通路，调节细胞增殖和凋亡，维持细胞数量的稳态。,二、GC/GR通过调节基因表达发挥抑制细胞增殖和抗细胞凋亡作用,作为转录调节因子，GR主要通过调节基因表达介导GC的作用GR促进或抑制基因表达的作用可以发生在转录和转录后水平目前了解比较多的是GR介导的转录调节。,（一）GC/GR调节基因转录的机制,迄今对GR调节基因转录的过程已有较深
7、入的研究，已证明没有与配体结合时GR主要存在于胞浆，GC与GR结合可以导致其激活，激活的GR转入核内，通过以下方式调节基因转录：通过蛋白质DNA相互作用直接调节靶基因转录 通过蛋白质蛋白质之间的相互作用间接调节靶基因转录,1.通过蛋白质DNA相互作用直接调节靶基因转录,配体结合的GR在核内与靶基因启动子(promoter)中具有增强子作用的糖皮质激素反应元件（glucocorticoid response element,GRE）结合，在该部位募集转录辅因子（如共激活因子），对组蛋白进行部位特异性的修饰，使染色质从紧密的抑制状态转为疏散的易于转录的激活状态。之后，核受体与RNA聚合酶II以及通
8、用转录因子（GTF）相互作用，直接促进基因的转录；或者通过与负性的GRE（nGRE）结合，取代该部位原有的转录因子，抑制靶基因的转录。,组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白,是一类小分子碱性蛋白质,有五种类型：H1、H2A、H2B、H3、H4，它们富含带正电荷的碱性氨基酸,能够与DNA中带负电荷的磷酸基团相互作用。,组蛋白是染色质中核小体的主要结构元件。核小体主要由四种组蛋白（H2A,H2B,H3和H4）构成。这四种组蛋白和缠绕着组蛋白的DNA共同组成了染色质。研究发现基因的表达并不仅仅由DNA决定，组蛋白的修饰（乙酰化、磷酸化和甲基化）所引起的结构变化同样能影响基因的开关，并且这种变化同样也
9、调控着基因的转录，影响着基因的表达。组蛋白的乙酰化和去乙酰化能打开或关闭某些基因，增强或抑制某些基因的表达。,在多种疾病中，都存在组蛋白编码错误的迹象。因此，有人将组蛋白编码称之为“第二套遗传密码”。组蛋白的乙酰化修饰对于研究基因的表达调控至关重要。蛋白的乙酰化和去乙酰化是蛋白活性调节的一种重要的形式，通过乙酰化或去乙酰化，改变了染色质结构或是转录因子的活性，可以调节基因转录的活性。,染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法.基本原理:在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切
10、断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀次复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片段的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息.该方法可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系.,2.通过蛋白质蛋白质之间的相互作用间接调节靶基因转录,GR可在转录水平与其他转录因子相互作用，调节启动子中不含GRE的基因表达。这种方式不需要GR与DNA结合。与其他转录因子相互作用的结果以抑制基因表达为主，其确切机制还不清楚，有可能与不同转录因子之间竞争数量有限的共激活因子有关。GR与AP-1、NF-B等转录因子之间的相互作用是GC/GR抗炎作用的重要机制之一。,NF
11、B与自身免疫性疾病,目前已有证据表明核转录因子NFB可能通过信号传导通路，调控基因的表达，从而参与了很多自身免疫性和炎症性疾病的发生和发展。,在正常情况下，NFB位于细胞胞浆内，一般由两个功能亚单位，即P65和P50，所组成，同时和其天然性的抑制因子IBa和IBb结合在一起，而后者阻止NFB进入细胞核，调控相关的靶基因。一旦细胞受到刺激（感染、氧化和抗原等），IB磷酸化，相应的蛋白酶体发生降解，NFB激活，进入细胞核，与靶基因结合，后者可产生大量的炎症介质（如白介素1b和肿瘤坏死因子a），引起炎症反应的发生，同时基因的产物会进一步激活NFB，从而扩大局部的异常炎症反应。,糖皮质激素可以抑制某些
12、转录因子和相应基因的表达，如AP1和NFB，从而抑制炎症反应。有证据显示，糖皮质激素可能是目前最强的NFB抑制因子。糖皮质激素可通过结合糖皮质激素受体，抑制活化的NFB（细胞胞浆内和细胞核核内），同时能抑制NFB与靶基因结合，起到抑制异常炎症反应的作用。最新研究显示，糖皮质激素还能增加NFB的抑制因子IB的转录和表达。由此可以推测：GC通过抑制NFB而抑制肿瘤细胞的增殖的机制可能与其上述抗炎机制是类似的。,GR与转录因子AP-1、NF-B、p53、STAT5等的相互作用在GC/GR对细胞增殖和凋亡调控中亦具有重要作用。已证明核转录因子NF-B的靶基因IL-6对激素非依赖性的前列腺癌（AIPC）
13、细胞具有明显增殖促进作用，Dex能抑制AIPC细胞的增殖。国内外研究结果均表明，GC/GR抑制NF-B的转录活性和IL-6的表达是GC抑制AIPC细胞增殖的重要机制之一。,（二）介导GC/GR对细胞增殖和凋亡调控作用的靶基因,已证实GC/GR的增殖抑制作用是通过对细胞周期（如G1期）的阻滞实现的.并发现GC抑制细胞增殖的作用与其调节细胞周期的调节性蛋白的表达有关。,GC/GR也可以通过调节凋亡相关蛋白的表达发挥抗凋亡作用，如有报道GC可以抑制凋亡诱导因子Fas或Bcl-2蛋白家族中促凋亡成员表达，上调Bcl-2蛋白家族中抗凋亡成员Bcl-2或凋亡抑制因子（Inhibitors of apopt
14、osis,IAPs）的表达产生抗凋亡作用。,GC/GR抑制增殖和抗凋亡的作用还与它们在多种细胞中诱导下列蛋白表达有关，如与AKT/PKB有高度同源性的血清和糖皮质激素调节蛋白激酶1（serum and glucocorticoid regulated kinase,Sgk）、MAPK磷酸酶（MAPKphosphatase-1,MKP-1）、胰岛素样生长因子结合蛋白1、细胞抑制和DNA损伤诱导的蛋白（growth arrest and DNA damage-inducible,GADD45）等。,在以往研究GR对细胞增殖和凋亡调节的基础上，选择了一些参与细胞增殖、凋亡和变形运动的重要信号转导蛋白
15、，研究了GC对它们的表达/活性的影响，发现了以下一些表达受GC调节的GR功能性靶基因。小G蛋白RhoB TGF1II型受体（TRII）信号调控蛋白（SIRP）,1.小G蛋白RhoB,RhoB是小G蛋白Rho亚族成员，有报道该蛋白具有抑制细胞增殖的作用，并能被多种细胞毒应激原，如紫外线（UV）和化疗药5-FU，顺铂等诱导。Dex在人卵巢癌HO-8910和骨肉瘤细胞中能以浓度和时间依赖性的方式上调RhoB mRNA和蛋白质表达，GR的抑制剂RU38486能够抑制Dex上调RhoB的作用，表明这种作用通过GR介导。,将野生型的RhoB表达载体转入HO-8910细胞，使其过度表达，可以使Dex抑制该细
16、胞增殖的作用增强；而用RNA干扰技术抑制RhoB的表达，则可明显阻断Dex的上述作用。以上结果表明，GR上调RhoB参与了GC对该细胞的增殖抑制作用。,用同样的方法也证明RhoB的上调与Dex诱导该细胞形态改变有关。近期的研究发现RhoB过表达或RhoB激活能使NF-B的核转位增加，基础转录活性增强，因此，推测过表达的RhoB有可能参与了GC对该细胞顺铂诱导的抗凋亡作用。,2.TGF1II型受体（TRII）,转化生长因子1（TGF1）对多种类型肿瘤细胞具有增殖抑制作用。介导其作用的有I型和II型TGF受体（TRI和TRII）。国外报道Dex能够抑制雄激素非依赖性的前列腺癌PC-3细胞的增殖，并
17、能诱导该细胞表达TGF1。Dex在PC-3细胞和HO-8910细胞中能上调TRII表达（约为对照的2.5倍）。该作用通过GR介导。,将含有TRII启动子的报告基因转入PC-3细胞中，证实Dex能够以浓度依赖性的方式增强TRII报告基因的转录活性，表明Dex上调TRII的作用发生在转录水平。用TRII抗体阻断实验显示该抗体能明显阻断Dex对PC-3细胞的增殖抑制效应，表明Dex能通过诱导的TRII表达，增强其信号转导介导其对PC-3细胞的增殖抑制作用。,3.信号调控蛋白（SIRP）,信号调控蛋白（Signal regulatory protein,SIRP）为一跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族和
18、抑制性受体家族成员。在单核巨噬细胞中高表达。其胞内区能够和多种具有酶活性的信号转导蛋白和接头蛋白结合，在多条信号转导通路发挥作用，参与多种细胞功能的调节，包括抑制细胞增殖、调节细胞的粘附和运动等。,近来发现在小鼠巨噬细胞（RAW264.7）中，Dex可以浓度和时间依赖性的方式诱导该蛋白的表达。而在用RNA干扰技术阻断了GR表达的稳转细胞系RAW-H5中，SIRP明显下调，其mRNA和蛋白质水平仅为对照的20%左右。将SIRP表达载体转入RAW-H5细胞，可以明显减慢细胞的增殖速率。以上表明SIRP表达受Dex调节，后者介导了GR对该细胞的增殖抑制作用。,三、GC/GR对细胞增殖、凋亡调控的其他
19、可能机制,GC/GR的非核作用或非基因组作用 GR非配体依赖性的作用,（一）GC/GR的非核作用或非基因组作用,GC/GR能通过快速的非基因组作用方式改变细胞内多种信号转导通路，如MAPK家族信号转导通路、PI-3K-AKB信号转导通路、Ca2信号转导通路等的活性状态，而这些通路又可以通过影响下游的转录因子的活性，最终导致细胞内基因表达的改变，参与了细胞的增殖、凋亡的调控。GC还能抑制Caspases（如Caspase3,89）的活性，产生抗凋亡效应。,（二）GR非配体依赖性的作用,用RNA干扰技术阻断了小鼠巨噬细胞系（RAW264.7）细胞中GR的表达，建立了GR表达受抑的稳转细胞系RAW-
20、H5，意外发现该细胞的增殖明显加快，传代后第6天细胞的数量是对照细胞的3倍左右。表明GR有明显抑制该细胞增殖的作用。用人工合成的Dex处理RAW264.7，在Dex浓度为10-7和10-6mol/L时细胞增殖的抑制率分别仅为25%和35%，这种配体作用和抑制受体表达导致的对细胞增殖影响的差异，提示GR抑制该细胞增殖的作用除了配体依赖性的以外，可能还具有配体非依赖性的作用。,近年来越来越多的报道显示,包括GR在内的核受体的转录激活功能并非只依赖于配体，受体的翻译后修饰，如磷酸化、硝化/亚硝基化（nitration/nitrosylation）、乙酰化等也可以影响受体与激素结合、核转位、DNA结合
21、和转录激活功能。如已证明多种跨膜信号转导通路中激活的蛋白激酶（如蛋白激酶A、ERK等）和磷酸酶能通过对核受体的可逆性磷酸化修饰，导致受体构象改变并影响其转录激活功能。,有报道将雄激素受体（AR）的表达载体转染没有AR表达的前列腺癌PC-3细胞，使其表达，可以导致该细胞的增殖和侵袭能力降低，同时细胞表皮生长因子受体（EGFR）的磷酸化和EGFR引发的PI-3K信号转导通路也减弱。用免疫共聚焦和免疫共沉淀方法显示EGFR和AR在细胞内有共同的定位，提示AR有可能通过直接与EGFR相互作用，改变其下游的信号转导通路活性，调节细胞的增殖、粘附和侵袭等生物学行为。GR是否也有与AR同样的作用方式是个有兴
22、趣的问题，值得进一步研究。,四、GR靶基因群或基因表达调控网络的研究,近年来一些实验室将高通量基因芯片技术和定量PCR技术相结合，研究GC处理组与对照组细胞基因表达的差异，以筛选对GC反应性的基因 优点：快速和高通量，实验获得的GC/GR靶基因数量多 缺点：用这种方法发现的表达差异的基因既可以是GR的直接靶基因（primary GR target gene），也可以是GR间接调节的靶基因,染色质免疫沉淀（Chromatin Imumnoprecipitation,ChIP）是一种用来研究蛋白质DNA相互作用的技术，用于检测每个候选靶基因的启动子区域是否存在能与特定转录因子结合的特定DNA序列，
23、如与GR结合的糖皮质激素反应元件（GREs）。如果一个基因的表达既受GC的调节，其启动子部位又存在GRE，则表明该基因是GR直接调节的靶基因。,Wang等用Dex处理体外培养的具有肺泡II型上皮细胞特点的人肺腺癌细胞A549后，用基因芯片分析和定量PCR方法观察了基因表达的改变，并用ChIP技术检测了在这些靶基因启动子区域可能存在的能与GR结合的调节序列。该研究证实了50个被GC诱导，21个被GC抑制的靶基因，根据这些靶基因的功能可以将它们分为抑制增殖、抗凋亡、抗炎和参与肺泡表面活性物质合成四个部分。,最新发展的染色质免疫共沉淀（ChIP）技术与高通量的基因芯片相结合的“ChIP-on-chi
24、p”技术，又被称为全基因组定位分析（genome-wide location analysis）可以高通量地筛选基因的启动子调控序列，从而确定转录因子调节的靶基因群。研究者可以平行地进行特定组织细胞的两方面的研究：一是用基因芯片技术得到基因表达差异的资料二是通过ChIP-on-chip分析，得到启动子定位分析的资料，将两组资料交叉对比，就可以确定特定转录因子的靶基因群或基因表达调控网络。,综上所述，由于GR分布于全身各组织器官，GC/GR的作用广泛而复杂，并具有细胞特异性，如GC/GR能诱导淋巴细胞凋亡，而对多种因素诱发的上皮细胞等的凋亡又有抑制作用，可以想象介导GC在不同组织器官调节的靶基因
25、并不完全相同，或通过影响其它信号转导通路间接影响基因表达。因此，寻找GC/GR的靶基因（包括组织特异性的靶基因），阐明这些基因与GC功能的关系还有很多工作要做。,除了GR直接调节的靶基因外，GR还能通过与其他转录因子作用影响基因表达，因而特定细胞特定时刻的基因表达状况不仅受GR的影响，还与存在于靶基因启动子中的其他转录因子的状况密切相关，显示的是细胞内多种信号转导通路通过各自下游的转录因子功能整合后的结果。,上述资料表明了研究GC/GR依赖性的基因表达群或GC/GR依赖性的基因调控网络（GR-dependent gene regulatory network）的必要性。当然除了GR配体依赖性的基因组作用外，有关GR配体非依赖性的作用，以及GC/GR的非基因组作用都令人感兴趣，都值得进一步研究。,总之，阐明GC/GR调节细胞增殖、分化和凋亡方面的作用和机制是留给我们的艰巨任务。,Thank you！,
