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1、输血前相容性检测,教学目的和要求,掌握盐水法、抗人球蛋白法、聚凝胺法的原理、方法及意义。熟悉微柱凝胶法原理、方法。了解酶法、白蛋白介质法、Liss法的原理和方法。熟悉ABO/Rh血型鉴定方法及影响因素熟悉抗体筛选原理和意义熟悉交叉配血方法及意义了解抗体鉴定原理和意义,血型鉴定,抗体筛选及鉴定,交叉配血,红细胞抗原抗体检测技术,红细胞抗原抗体检测技术应用,微柱凝胶免疫学技术,聚凝胺试验,酶介质凝集试验,盐水介质凝集试验,抗人球蛋白试验,增强技术,盐水介质凝集试验,悬浮于盐水介质中的红细胞与相应抗体分子结合，交叉联结形成肉眼可见的凝集。主要检测IgM类抗体（ABO系统、抗E）。抗A抗B特异性IgG
2、类抗体有时可直接凝集悬浮于盐水中的红细胞，与红细胞表面抗原位点数目和抗原决定簇位置有关。,盐水介质凝集试验,方法：玻片法-便于显微镜观察结果 试管法-适用于不同温度、便于洗涤反应温度：422临床意义：盐水凝集试验阳性，并在37也有活性的抗体有意义，这些抗体通常能用其他方法证明。室温有活性，37无活性者临床意义不大。,试验记录4+（+）：一个大凝集块，背景透明，无游离细胞3+（+）：数个大凝集块，背景透明，无游离细胞2+（+）：许多小凝集块，背景稍混浊，有游离细胞1+（+）：细小的凝集块，背景浑浊W+（）：极细小凝集块，要用显微镜观察结果0（-）：无凝集，无溶血，细胞呈游离散在状态PH：部分溶血
3、H：完全溶血,Weak reactions often difficult to interpret.Can also be downgraded due to shaking the completed test.,Conventional Testing.,盐水介质凝集试验,结果分析：阳性-凝集或溶血 阴性-无凝集或溶血先观察有无溶血、再观察有无凝集注意事项：细胞浓度25%（严格按说明书操作）、血清与细胞比例、反应温度、弱凝集分析优点：简便、快捷、直观。缺点：不能发现不完全抗体。,微柱凝胶免疫学技术,聚凝胺试验,酶介质凝集试验,盐水介质凝集试验,抗人球蛋白试验,增强技术,抗人球蛋白试验,抗
4、球蛋白试验是1945年由Coombs等人建立的，又称Coombs试验。抗球蛋白试验的建立在血型血清学上有着非常重要的意义。分为直接抗球蛋白试验（DAT）和间接抗球蛋白试验（IAT）。,抗人球蛋白试验原理,IgG类血型抗体（主要是免疫抗体，如Rh血型抗体）分子量小，与红细胞相应抗原结合后，在盐水介质中不出现肉眼可见的凝集反应，称之为不完全抗体，但在加入抗-IgG后，以其搭桥作用则可出现凝集反应。补体成分在体内被红细胞抗原抗体复合物激活以后，结合在红细胞表面。在体外含补体的多克隆抗体，或抗C3b、抗C3d等单特异性抗体与补体致敏的红细胞反应，使之凝集也称为抗球蛋白试验。,抗人球蛋白试剂,多特异性抗
5、球蛋白试剂：应含有抗IgG和抗-C3d。单特异性抗球蛋白试剂：抗IgG、抗IgM、抗IgA、抗C3、C4的片段。,直接抗人球蛋白试验,DAT是用来检测体内红细胞致敏情况，尤其是IgG和C3d包被的红细胞。用于：HDN和自身免疫溶血性贫血的诊断红细胞被药物抗体致敏的检查急性和迟发性溶血性输血反应的检查,间接抗人球蛋白试验,用于测定在体外能引起红细胞致敏的抗体。用不完全抗体测定红细胞血型，如Rh血型。交叉配血。,结果分析-假阳性,用免疫兔或羊制备的抗人球蛋白含有种间抗体。红细胞在用盐水洗涤时已有凝集。IAT试验中所用红细胞本身DAT阳性。不抗凝标本在冷环境里经过一段时间的保存后，自身冷抗体发生作用
6、，激活补体，补体成分结合在红细胞上，用多特异性抗球蛋白试剂会发生假阳性。离心过度，红细胞压积过紧，不易充分摇散,结果分析-假阴性,致敏后的红细胞洗涤不充分,残留的球蛋白中和了试剂中的抗球蛋白，造成假阴性。操作过程不连续，时间过长，结合在红细胞上的抗体解离。红细胞、血清和抗人球蛋白试剂保存不当都可能发生活性减弱或丧失。红细胞过多，反应减弱；红细胞过少，看结果不准确，都影响结果。试剂中抗人球蛋白浓度过大，有前带现象。孵育时间和温度不当，会使反应结果减弱或变为假阴性。观察结果时过度摇动试管，摇散细小凝块。,注意事项,每次试验要设有阴性和阳性对照。阴性结果要加入一滴IgG致敏红细胞实验器材清洁。注意抗
7、原抗体比例、孵育时间、温度等条件。严格按照实验方法操作。排除自身抗体干扰。,微柱凝胶免疫学技术,聚凝胺试验,酶介质凝集试验,盐水介质凝集试验,抗人球蛋白试验,增强技术,抗人球蛋白试验,微柱凝胶试验,原理：微柱凝胶技术是用特定的化学物质做成微型凝胶柱，柱的上端有一个加样反应室。抗原抗体反应后离心，凝胶柱起过筛作用，红细胞凝集块不能通过凝胶的间隙而留在凝胶的上部，未凝集的红细胞通过凝胶的间隙，沉积到底部。,微柱凝胶反应本质：凝集反应,红细胞抗原与相应抗体反应出现凝集。根据红细胞在胶质介质中的位置肉眼判断。,结果判断标准,结果判定标准,微柱凝胶试验注意事项,严格按照试剂说明书操作。献血者DAT阳性，
8、干扰结果判读。患者自身抗体干扰。注意加样顺序。配制细胞浓度准确。,微柱凝胶免疫学技术,聚凝胺试验,酶介质凝集试验,抗人球蛋白试验,增强技术,抗人球蛋白试验,盐水介质凝集试验,聚凝胺试验,原理：聚凝胺是一种多价阳离子聚合物，在溶液中有多个阳离子基团，能中和红细胞表面的负电荷，并籍助正负电荷的作用，引起红细胞的非特异性凝集。当红细胞与血清在低离子介质中孵育后，IgG抗体与红细胞上相应的抗原结合，在聚凝胺的作用下发生凝聚。凝集和凝聚在表面上不能区分，再加入枸橼酸钠重悬液，枸橼酸根的负电荷与聚凝胺上的正电荷中和，非特异性凝集现象消失，而真正的凝集不会消失。,+聚凝胺,+,无凝集,+,有凝集反应,-枸橼
9、酸纳-,聚凝胺试验,优点：简便快捷，可用于某些不完全抗体检测。缺点：对无唾液酸的红细胞无作用，例如多凝集红细胞。可增强自身抗体或冷凝集素干扰。注意事项：抗原抗体比例适当 聚凝胺（1液）去除干净。,微柱凝胶免疫学技术,聚凝胺试验,酶介质凝集试验,盐水介质凝集试验,抗人球蛋白试验,增强技术,抗人球蛋白试验,酶介质凝集试验,原理：红细胞表面有丰富的唾液酸，带有负电荷，使红细胞相互排斥。蛋白水解酶能消化破坏这种唾液酸，减少红细胞表面的负电荷以及红细胞之间的排斥力，缩短了红细胞之间的距离，使IgG分子能与有相应抗原的红细胞产生凝集。,酶介质凝集试验,常用的酶：菠萝酶、木瓜酶、胰酶、无花果酶。方法：期法-
10、酶液直接加入血清和细胞的混合物中。期法-用酶处理细胞再与血清进行反应。两种方法比较：期法 操作方便 期法 敏感,酶介质凝集试验,优点：可以增强一些抗原抗体系统的反应活性 Rh和Kidd系统最明显缺点：会破坏一些抗原的结构(M、N、Fya、Fyb)酶液批次不同，都需标化最适孵育时间。操作繁复，少数人对酶液过敏。,微柱凝胶免疫学技术,聚凝胺试验,酶介质凝集试验,盐水介质凝集试验,抗人球蛋白试验,增强技术,抗人球蛋白试验,增强技术,白蛋白增强凝集法原理：白蛋白能提高红细胞悬浮液中的介电常数，从而降低zete电位，缩小了细胞间距离，增加细胞与细胞的接触面。应用：血型鉴定和交叉配血结果判定：出现凝集和溶
11、血现象为阳性结果。,增强技术,低离子强度盐溶液（Liss）法 原理：在凝集反应第一阶段，若降低介质的离子强度，就会减少红细胞周围的阳离子云，促进带正电荷的IgG与带负电荷的红细胞发生反应。注意事项：不能增加额外血清量延长孵育时间会使某些抗原变质，如Fya。,抗体筛选及鉴定,交叉配血,红细胞抗原抗体检测技术,红细胞抗原抗体检测技术应用,红细胞抗原抗体检测技术,血型鉴定,ABO血型鉴定,方法：常用室温盐水技术检测红细胞上的血型抗原，以及血清中存在的血型抗体。结果判定参见凝集试验。ABO血型鉴定的常规试验：1、正定型：用已知抗体的标准血清检查红细胞上未知的抗原。常规用抗A抗B 2、反定型：用已知血型
12、的标准红细胞检查血清中未知的抗体。常规用A、B和O三种红细胞。,正反定型的意义,准确的血型判定利于指导临床用血发现亚型抗原强度的改变与疾病相关新抗原出现与疾病相关排除假阴性或假阳性结果干扰,ABO血型反应格局,血型 正定型 反定型 抗A 抗B Ac Bc Oc A+-+-B-+-O-+-AB+-,Cells v Serum,Serum v Cells,ABO亚型鉴定,亚型通常表现为凝集反应强度弱，或正、反定型不符 增加试剂：抗A1-区分A1和A2 抗H-有较强的H抗原性 抗A,B-与Ax的反应强度增强 增加方法：吸收放散试验 唾液中血型物质鉴定 PCR方法,Rh血型鉴定,红细胞Rh表型可用特殊
13、的具有抗D、C、c、E、和e抗血清检测来鉴定。但常规只用抗D血清检查有无D抗原 D抗原阳性者为Rh阳性，否则为阴性,Rh血型鉴定方法,Rh抗体属IgG类，一般不能在盐水介质中与红细胞发生凝集，因此须采用以下鉴定方法（其中一种）：1、酶介质法2、抗人球蛋白法+增强试验（Liss/白蛋白技术）RhD检测常用盐水法。,血型鉴定,交叉配血,红细胞抗原抗体检测技术,红细胞抗原抗体检测技术应用,红细胞抗原抗体检测技术,抗体筛选及鉴定,抗体筛选和鉴定,有临床意义的抗体：能引起新生儿溶血病、引发溶血性输血反 应，或者使输入的红细胞存活期减少，在 37有反应的同种抗体。意外抗体：抗A，抗B以外的抗体。,目的和原
14、则,目的：对受血者的血清或血浆，应常规作抗体筛选实验，以发现有临床意义的意外抗体。原则：让受检血清或血浆与特殊的试剂红细胞（筛选细胞）起反应，以发现37有反应活性的抗体。,对血清中抗体检测的要求,选择足够敏感、高特异性的技术检测出受检者血清中低水平的有临床意义的抗体。2.要高度注意，即使受血者血清中的抗体对输入的不相容红细胞抗原呈弱反应，也能够发生快速回忆反应，抗体迅速产生，破坏红细胞。,对试剂红细胞的要求,不能将多人份红细胞混合，一定要用2-3人份的试剂红细胞，以避免红细胞混合后，对弱抗原红细胞的稀释。美国FDA对注册和批准作为商品供应的用作不规则抗体筛检的试剂红细胞的要求为必须表达：D、C
15、、E、c、e、M、N、S、s，Pl、Lea、Leb、K、k、Fya、Fyb，JKa、JKb。,临床重要的人血清红细胞抗体,抗体筛选方法,盐水凝集法抗人球蛋白法聚凝胺法微柱凝胶法LISS抗球蛋白法,结果的判读和解释,溶血和血液凝集意义相同，都是抗原抗体反应阳性结果。先观察有无溶血，后观察有无凝集。记录结果，并与以前结果对照。抗体筛选试验不一定能检出所有有临床意义的抗体。一些低频抗原的抗体或有剂量效应的抗体，可能被漏检。,抗体鉴定,通过筛选，抗体一经检出，应进一步作抗体鉴定试验，以确定其特异性。自身细胞检查-排除非特异性2.谱红细胞检查,谱红细胞：一般是由8-16人份的已知血型表现型O型红细胞组成
16、，具有各种不同的抗原成分，根据谱红细胞的反应格局一般可以鉴定常见的抗体。方法：在盐水法基础上、灵活应用白蛋白介质法、酶技术及抗人球蛋白实验。,血型鉴定,抗体筛选及鉴定,交叉配血,红细胞抗原抗体检测技术,红细胞抗原抗体检测技术应用,红细胞抗原抗体检测技术,交叉配血,主侧：受血者血清+供者红细胞检测对供者红细胞起反应的抗体次侧：受血者红细胞+供者血清检测对受者红细胞起反应的抗体自身对照：受血者红细胞+受血者血清排除自身抗体、直接抗球蛋白试验阳性及红细 胞缗钱状凝集干扰,接收申请单和血标本,核对无误（如有错误与医生/护士联系）,进行交叉配血,相合结果输入微机,不相合,打印发血单,血液中心,交叉配血工
17、作流程,注意事项,用于交叉配血的标本应该是新获得的（3天之内）；供者血标本应刚从血袋上剪下。不能用玻片法作交叉配血。必要时用生理盐水洗涤细胞。红细胞浓度一般是2-5%。严格按照试剂说明书操作。,抗筛和配血结果分析,红细胞方面问题处理,血清方面问题处理,常见问题处理,红细胞抗原抗体检测技术,抗体筛选和交叉配血结果分析,抗体筛选阴性，交叉配血相合见于临床上绝大多数标本。抗体筛选阴性，血清中仍有可能含有临床有意义的抗体（方法或筛选细胞）盐水介质试验作配血可能漏检有意义的IgG类抗体。只有用非盐水介质交叉配血，才能保证待输的血和受者相合。,抗体筛选和交叉配血结果分析,抗体筛选阴性，盐水直接离心交叉配血
18、不合ABO血型错误。抗A1存在于A2或A2B，在直接盐水交叉配血实验中，抗A1能引起大部分A型红细胞不相合。存在室温反应的同种抗体，如抗M。,抗体筛选和交叉配血结果分析,抗体筛选阴性，抗人球蛋白交叉配血不合献血者红细胞DAT阳性（约1/10000）患者抗体弱，献血者红细胞抗原性很强，表现为抗人球蛋白试验阳性。针对低频抗原的抗体，如Diego系统抗-Wra。,抗体筛选和交叉配血结果分析,抗体筛选阳性，交叉配血不合同种抗体、自身抗体、试剂问题、缗钱状凝集，应在输血前查明原因。必须进行包括抗人球蛋白试验在内的交叉配血。紧急情况下无法找到血清学配合的血液时，输血科人员应告之主管医生此种情况下输血存在的
19、可能危险。,同种抗体的处理对策,交叉配合相合与否取决于涉及抗原的频率。鉴定抗体的特异性后，先用抗血清筛选相应抗原阴性者，再与受者血清作交叉配血。用受血者血清还是试剂抗血清筛选血液，应根据病人的血清反应强度，能得到的受者血清量以及抗血清的来源和费用等决定。医院库存血中难以找到配合血时，求助血液中心。,自身抗体,冷自身抗体干扰血型鉴定、抗体筛选和鉴定以及交叉配血试验，结果判读困难。最常见的特异性是抗-I。温反应自身抗体很少引起ABO定型困难，但可引起Rh定型困难。注意：确认有无同种抗体；血型定型的准确性。,常见问题处理,红细胞方面问题处理,血清方面问题处理,红细胞抗原抗体检测技术,抗筛和配血结果分
20、析,红细胞抗原抗体检测技术,常见问题处理方法,了解患者一般情况。在做进一步试验之前，先进行重复试验。用试管法。初步检查：再取一份患者新鲜标本；红细胞洗涤后配成25%浓度；重复进行各项试验；直接抗人球蛋白试验；用ABO及自身细胞检测血清，怀疑抗I，用脐血细胞检查。判定结果之前，实验管至少在室温和4放置30分钟，阴性者用显微镜观察结果。,红细胞方面异常的处理方法,缺乏抗原或弱抗原：在常见问题处理方法基础上，进行吸收放散试验、检查唾液血型物质、PCR方法等。获得性B抗原：核对患者诊断；自身细胞自身血清 无凝集；酸化抗血清（抗B）凝集消失；检查唾液有A物质 无B物质。包被抗体红细胞：IgG致敏红细胞-热洗脱法；醚洗脱法。IgM致敏红细胞-硫醇处理。,红细胞方面异常的处理方法,多凝集红细胞：Tn受体；被细菌酶激活T或Tk受体；遗传产生Cad抗原活性对策：用木瓜酶处理细胞破坏Tn受体；用T激活的红细胞吸收抗A抗B后检查；用A/B细胞吸收抗A/B，用放散液检测Cad阳性细胞。混合凝集外观：凝集或溶血方式,血清方面异常的处理方法,缗钱状凝集：盐水替代法。抗A1：用标准抗A1血清与该细胞反应无凝集；只与A1细胞凝集，与A2和O细胞均无凝集。不规则抗体：抗体筛选；抗体鉴定血清中缺乏抗A/B：核对患者一般情况；试管法；加大血清量；延长反应时间。,
