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1、植物基因的同源克隆陈桂信福建农林大学园艺学院,植物基因同源克隆的原理,拟分离的基因在目标植物上没有报导过,然而在其它植物上有过报导，在genebank上搜索已分离出的该基因的核苷酸序列或氨基酸序列，通过序列同源性比较找出该基因的保守区，并在该保守区内设计寡核苷酸引物，通过扩增得到目标植物该基因的保守区片段，再通过基因组文库筛选获得该基因的全长，或通过cDNA文库筛选和（Rapid Amplification of cDNA ends)获得该基因的cDNA全长。,植物基因同源克隆的策略,1.植物基因组DNA的提取与纯化 保守区引物设计 PCR扩增 基因保守区片段 构建基因组文库 基因文库筛选 基
2、因全长的获得,2.植物总RNA的提取与纯化 逆转录 cDNA 保守区引物设计 PCR扩增 构建cDNA文库 保守区cDNA片段 设计RACE引物 5/-RACE 3/-RACE cDNA文库筛选 基因的cDNA全长,植物基因组DNA的提取与纯化 1.CTAB法:提取缓冲液为 100mM Tris-HCl(pH8.0)1.4M NaCl，20mMEDTA(pH8.0)，2%（W/V）CTAB。2.SDS法：提取缓冲液为 100-200mM Tris-HCl(pH8.0)，0.25-0.5MNaCl，25-50mM EDTA(pH8.0)，0.5-2.0%（W/V）SDS（单独加）。,植物DNA的
3、提取方法,植物DNA提取的必经步骤,1.破碎细胞壁:液氮研磨。2.裂解细胞：CTAB（Cetyl Trimethyl Ammonium Bromige，十六烷基三甲基溴化铵)或SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，十二烷基磺酸钠）裂解膜结构，EDTA螯合核酸酶中的Mg2+，65保温30-60min 钝化内源核酸酶。3.去除多酚类、多糖等次生物质。4.去除蛋白质：用酚、酚与氯仿（1:1）、氯仿与异戊醇（24:1）抽提；5MKAc（pH7.5)沉淀蛋白质；蛋白酶K水解蛋白质。5.沉淀核酸：倍体积冰冷的异丙醇；2倍体积的无水乙醇；70%乙醇清洗沉淀中的无机离子。6.除RNA：用RNa
4、se消化；用LiCl沉淀RNA。7.浓缩DNA：0.1倍体积3MNaAc(pH5.2)和2倍体积无水乙醇沉淀。8.溶解DNA沉淀：0.1或1TE(pH8.0）或无菌双蒸水。,植物DNA提取的难点,1.多酚类物质的干扰:多酚类物质被氧化后，与DNA分子发生不可逆的结合，使提取的DNA样品呈棕褐色。2.多糖类物质的干扰：多糖与DNA形成粘稠的胶状复合物，DNA被包埋在这种复合物中难于溶解。3.其它次生物质的干扰：乳胶、树脂等，与DNA共沉淀。这种褐色、粘稠的DNA不易被限制性内切酶和Taq DNA聚合酶所识别，从而导致PCR扩增和酶切的失败。,多酚、多糖与其它次生物质的去除,1.材料的选择与处理：
5、新鲜、幼嫩嫩芽、嫩叶、幼苗；叶片的饥饿处理：4黑暗处理1-2天，消耗淀粉和多糖。在研磨后用-20预冷的丙酮抽提2次。2.在细胞裂解之前分离细胞核（两步法）除多糖和多酚：研磨：破坏细胞壁，释放果胶类多糖细胞器与核膜保持完整 加入核分离缓冲液（不含去垢剂）混匀 低速离心去上清（多糖、酚类）加入含去垢剂的核裂解液。3.调整提取缓冲液的组成除多糖和多酚：NaCl：浓度为0.7M时，RNA与DNA溶于CTAB，而多糖不溶解，CTAB与多糖和残留的蛋白质形成复合物，通过氯仿或酚抽提停留在界面上，容易去除；浓度为0.4M时，核酸沉淀。CTAB：常用2.0%，多糖含量高的可提高至3.0%。pH值：通常为8.0
6、，低pH（5.5）能避免酚类物质的电离和随后的氧化。,4.在提取缓冲液中加入抗氧化剂除多酚：-巯基乙醇、抗坏血酸纳、半胱氨酸、二硫苏糖醇等提供巯基（-SH），与酚类物质竞争氧，防止酚氧化成醌，-巯基乙醇：常用0.1-2.0%，酚类高的可用至5.0%。有的在提取缓冲液中加入PPO的抑制剂如0.1%(W/V)DIECAdiethyldithiocarbamic acid。5.研磨时加入大分子聚合物或吸附剂除多酚：PVP、PVPP：2-6.0%（W/V）；活性炭：0.1-0.3%（W/V）。,6.高盐去多糖法：在氯仿/异戊醇的抽提后的水相中加入0.5V的5MNaCl混匀，然后加入2V的无水乙醇沉淀D
7、NA，大部分多糖留在上清液中；在DNA的水溶液中，加入5MNaCl使其终浓度为，以2.0M除糖效果最好。7.CTAB/NaCl溶液（4.1%NaCl，10%CTAB）提取与氯仿/异戊醇抽提法除多糖：将DNA样品中的NaCl浓度调整到0.7M，加入0.1V的CTAB/NaCl溶液，混匀后用氯仿/异戊醇抽提，直到白色界面（多糖与其他大分子污染物）消失为止。,8.使用糖苷水解酶：在DNA的粗提液中同时加入RNase和糖苷水解酶（如caylase M3），在去除RNA的同时，也除去果胶类多糖。9.柱层析法除多糖：RPC-5反向柱层析；Syphacryl S-1000柱层析，结合PEG8000沉淀DNA
8、相结合。10.稀释DNA样品：2ng DNA模板/反应。11.CsCl（氯化铯）梯度离心。,植物总RNA的提取,植物总RNA提取的必经步骤,1.破碎植物组织细胞。2.核蛋白变性释放出RNA。3.抑制内外源RNase的活性。4.将RNA、DNA、蛋白质及其它细胞物质分开。,植物总RNA提取的常见方法1.胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和-巯基乙醇变性蛋白质并抑制RNase活性，经过多次酚/氯仿抽提后，再沉淀RNA。2.苯酚法：用SDS变性蛋白并并抑制RNase活性，经过多次酚/氯仿抽提去除蛋白、多糖、色素等杂质后，再用NaAc和乙醇沉淀RNA。3.LiCl沉淀法：0.8MLiCl会特异沉淀RNA。4
9、.CTAB法。,植物总RNA提取的难点1.内外源RNase的污染。2.多酚类物质的干扰3.蛋白质的干扰 4.多糖的干扰,创造一个无RNase的环境,1.器械的消毒：用0.1%DEPC二乙基焦碳酸盐（Diethyl Pyrocarbonate)浸泡处理2hr以上，然后高压灭菌去除DEPC；或高温（250）干热消毒4hr以上或200干热消毒过夜。2.溶液的消毒：除Tris-HCl外，所有溶液应加DEPC至终浓度为0.05-0.1%，处理过夜后高压灭菌。3.整个操作过程应在超净工作台上进行，且应戴手套操作。4.所有操作应在冰上进行。,植物总RNA提取过程中主要试剂的作用,1.DEPC：与RNase的
10、组氨酸结合，使蛋白质变性。与0.1-1mg/ml肝素联合使用，具有极强的RNase抑制效果。它在Tris中易分解形成CO2和乙醇，使pH值下降。2.阴离子去垢剂：SDS，Sarkosyl，脱氧胆酸钠（DOC）解聚核酸与蛋白质的结合，在高浓度钾离子存在时，形成SDS-蛋白质的复合物沉淀。3.胍盐、-巯基乙醇：是解偶剂，破坏蛋白质的二硫键。4.RNasin：是RNase的一种非竞争性抑制剂，不能与7.0M尿素混合使用。,5.氧钒核糖核苷复合物：与RNase结合形成过渡态类似物。使用浓度为10mM。6.酚、氯仿：使蛋白质变性。7.多胺、蛋白酶K、共聚酪氨酸-谷氨酸：抑制RNase的活性。8.LiCl
11、：RNA的选择性沉淀剂。,植物总RNA提取过程中多酚类物质干扰的排除,1.在提取缓冲液中加入还原剂：-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）、半胱氨酸、硼氢化钠（NaBH4)。过夜沉淀RNA时加入1%-巯基乙醇。2.研磨时加入螯合剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）CO-N=基在pH8.0以下时有结合多酚的能力。3.用-70的丙酮抽提冷冻研磨的植物材料。4.降低提取缓冲液的pH值（5.5）。5.使用Tris-硼酸缓冲液（0.2M）。6.在提取缓冲液中加入牛血清白蛋白（BSA）和肝素。7.用LiCl或CaCl2、50%2-丁氧乙醇选择性沉淀RNA。,植物总RNA提取过程中多糖干扰的
12、排除,1.低浓度乙醇沉淀多糖法：在提取缓冲液中或在RNA水溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度为10-30%，可以沉淀多糖，RNA留在上清液中。一般在匀浆液中或匀浆上清液中加入终浓度为10%的无水乙醇，在RNA的水溶液中加入终浓度为30%的无水乙醇，以沉淀多糖。2.醋酸钾沉淀多糖法：在匀浆液中加入1/5-1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）或加入1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）以沉淀多糖；在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾（pH4.8）以沉淀多糖。,3.调整提取缓冲液中NaCl的浓度：。4.将酚/氯仿抽提的上清液稀释使钠离子浓度为 80mM，然后加入0.4倍体积的
13、2-丁氧乙醇沉 淀多糖。,植物RNA提取过程中蛋白质污染的排除,1.在冷冻条件下研磨植物材料，以抑制 RNase的活性。2.在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂（苯 酚、胍、SDS、CTAB等）。3.利用蛋白酶K降解蛋白质。4.利用苯酚、氯仿抽提。5.用70%高氯酸钠溶液沉淀蛋白质。,植物DNA和RNA的检测,1.凝胶电泳：琼脂糖浓度为0.7-1.0%，胶用1TAE或1或0.5TBE电泳缓冲液配制，加入0.5g/ml溴化乙锭（EB），平板胶厚度为3-5mm。上样缓冲液：溴酚蓝，DNA或RNA样品：2-5l，电压：4-5V/cm，时间：2040min。2.紫外吸收法：波长为260nm、280nm时的吸
14、收值，1OD260=50g/ml双链DNA，1OD260=40 g/ml单链 DNA或RNA。单链DNA：浓度C（g/ml）=OD260/0.027，双链DNA：浓度C（g/ml）=OD260/0.020，单链RNA：浓度C（g/ml）=OD260/0.025。DNA 纯品：/OD260/OD280=1.8-1.9，RNA纯品：OD260/OD280，低于此值，说明有蛋白质或酚类污染。,木奈基因组DNA粗提液电泳图,木奈基因组DNA纯化电泳图,木奈总RNA粗提液电泳图,木奈总RNA纯化电泳图,木奈果肉总RNA电泳图,植物基因的同源克隆,植物基因保守区片段的克隆,植物基因序列同源性的比较,植物基
15、因同源序列的搜寻,进入GeneBank：美国国家生物技术信息中心（national centre for biotechnology information,NCBI)，网址为。,NCBI的使用,在search选项中选择nucleotide,在For选项中输入所要搜寻基因的名称,按go,就可搜寻genebank中已经克隆的基因的序号、基因名称、注册号；双击BD085077.Polyphenol oxidas.gi:22630687 就显示基因的全部内容，在display选项中选择genebank。,搜寻到基因的内容,LOCUS BD085077 1319 bp DNA linear PAT 2
16、7-AUG-2002 DEFINITION Polyphenol oxidase genes from banana,tobacco and pineapple.ACCESSION BD085077 VERSION BD085077.1 GI:22630687 KEYWORDS JP 2001525677-A/9.SOURCE Ananas comosus.ORGANISM Ananas comosus Eukaryota;Viridiplantae;Streptophyta;Embryophyta;Tracheophyta;Spermatophyta;Magnoliophyta;Liliop
17、sida;Commelinidae incertae sedis;Bromeliaceae;Ananas.REFERENCE 1(bases 1 to 1319)AUTHORS Robinson,S.P.TITLE Polyphenol oxidase genes from banana,tobacco and pineapple JOURNAL Patent:JP 2001525677-A 9 11-DEC-2001;COMMONWEALTH SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH ORGANISATION COMMENT OS Pineapple PN JP
18、2001525677-A/9 PD 11-DEC-2001 PF 19-MAY-1998 JP 1998549703 PR 19-MAY-1997 AU PO 6849 PI SIMON PIERS ROBINSON PC C12N15/53,A01H1/00,A01H5/00 CC Polyphenol oxidase genes from banana,tobacco and pineapple FH Key Location/Qualifiers FT CDS(1).(1053).FEATURES Location/Qualifiers source 1.1319/organism=An
19、anas comosus/db_xref=taxon:4615 BASE COUNT 332 a 347 c 406 g 234 t,基因序列同源性的比较,双击DNAMAN图标，打开DNAMAN的页面，双击工具栏中的空白文档图标，在文件菜单中选择open选项，打开genebank中基因的内容，或直接双击打开图标，打开genebank中基因的内容。,将genebank的基因序列转变成seq文件,选中genebank中的基因序列，按复制或ctr+C，双击DNAMAN工具栏中的空白文档图标，按粘贴或ctr+V，把基因序列粘到DNAMAN上，先从edit菜单中点击Select All，然后点击Sequ
20、ence Format，弹出对话框，单击确定；先从sequence菜单选择Load sequence，然后选择display选项，在File菜单中选择save as，输入文件名，在其后加上“.seq”。,序列同源性的比较,从Sequence菜单中点击Alignment，选择multiple sequence alignment，弹出对话框，点击Add中的file，输入两个以上的基因序列，单击确定，出现序列同源性高低的结果，单击on，选择mono-tree，单击on，在进化树上出现同源性数值。,ORIGIN 1 ttgccgtttt ggaattggga cgcgccgggg ggcatgcag
21、a tcccggccat ctacgccgac 61 gcttcgtccc cgctctacga caagctgcgc aatgcgaagc accagccgcc gactttggtc 121 gacctcgact acaacggcac cgacccgacc ttcacccctg agcagcagat cgcccacaac 181 ctcaccatca tgtaccgaca ggtgatatcc ggcgggaaga cgccggagtt gtttatgggc 241 gcggcgtacc gcgcgggcga cgcgccagac ccgggcgcag gcactctaga gctcgtgc
22、cg 301 cacaacacga tgcatttgtg gaccggcgac cccaaccaac ccaacgacga agacatgggc 361 acgttctacg cggcggcgcg ggaccccatc ttcttcgccc accacggcaa cgtcgaccgc 421 atgtggtacg tgtggcggaa actcgggggc acgcaccgcg atttcaccga ccccgactgg 481 ctcaacgcgt ccttcctctt ctacgacgag aacgcgcagc tcgtccgcgt caaagtaaag 541 gactgcttga gc
23、gccgacgc gctgcggtac acgtaccagg acgtcgacat cccgtggatc 601 agtgcgaagc cgacgccgaa gaaaacaccg gggggcgctg cgccttccac gacagaggct 661 atatttccgg tggtgctgga taagccggtg agctctacgg tggcgaggcc gaagacgggg 721 aggagtactg gggaggagga ggtgttggtg gtggagggaa tcgagctgga caaggacgtg 781 gccgtgaagt tcgacgtgta tataaacgcg
24、ccggacaacg aaggggtggg gccggaggcg 841 agcgagttcg cagggagctt cgtccaggtg ccgcacaagc acaagaaggg gaagaaggag 901 aaggcgagga ttaaaacgac gctcaggctc gggataacgg acctgctcga ggacatcggc 961 gccgaggacg acgagagcgt gctcgtcacg ctcgtgccga ggataggcga ggggttggtc 1021 aaggttggtg ggctaaggat cgatttctcc aagtgatcag cagcaaat
25、ta actatacatg 1081 aaagtaaaaa aaattgcatt tacctaccta tagaagagaa taaatgcgta tgtaatctgc 1141 cccatttgtc acttttaatt tctcgagcgt gttctgaatg agagttgcat gcatgcgcgc 1201 agccataatg cctggtatag tgtagtagtt taggcgtgga tacgtataac gtacgtatgc 1261 atgtataagg aataatgatg agtttactat gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa/Rev
26、ised:July 5,2002.Disclaimer|Write to the Help DeskNCBI|NLM|NIH,多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术,PCR扩增引物设计,1.引物序列应位于基因的高度保守区内，且与非扩 增区域无同源性，提高PCR的特异性。2.引物的长度以15-30bp为宜，常用23-25bp。3.引物的碱基应尽可能随机分布，避免出现几个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C碱基的含量在40-75%之间，常用50-55%。,4.引物内部应避免形成二级结构，特别是引物 的应无回文结构。5.上下游引物不应有互补序列，特别是3/端应避免互
27、补，以免形成引物二聚体。6.引物的5/端碱基无严格限制，可加上内切酶位点、启动子序列或其他序列（最多可加10个碱基），便于对PCR产物进行分析和克隆。,7.引物3/端的头1-2个碱基会影响Taq DNA聚合酶的延伸效率，影响PCR的扩增效率和特异性，一般PCR的引物3/末端的碱基最好是C、G，其次为T，不用A，因为末位为A，错配时引发链合成效率大大降低，末位为T，错配时也能引发链的合成。8.引物的3/端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码少的氨基酸如Met、Trp，且要避免引物的3/末端不应终止于密码子的简并碱基。9.尽量采用植物偏好的密码子或在高度简并位点用dI代替。,植物偏爱的密码子,氨基酸
28、密码子氨基酸密码子Gly(G)GAA Ile(I)ATCGlu(E)GAG Thr(T)ACCAsp(D)GAT Trp(W)TGGVal(V)GTT Cys(C)TGCAla(A)GCT Tyr(Y)TACArg(R)AGG Leu(L)CTTSer(S)TCT Phe(F)TTCLys(K)AAG Gln(Q)CAAAsn(N)AAC His(H)CACMet(M)ATG Pro(P)CCA,用DNAMAN设计PCR引物,在Primer菜单中点击Self-complementarity，弹出对话框，显示no complementarity found，说明引物无自身互补，关闭对话框，打开序
29、列同源性比较的结果，检查对应的每个碱基是否存在简并，在简并位置上使用I或偏爱密码子或简并密码，将引物序列转变成.seq文件，保存到特定位置，到此，上游引物设计完成。,将下游的经设计和确定的序列转变成.seq文件，保存；打开该序列，选定，在Sequence菜单中点击load sequence，然后点击Display和，在Primer菜单中选择Two Primer Complimentarity和Second Primer Fom Input，输入上游引物序列，点击OK，显示两个引物的互补情况，在3/端不应出现连续4个的互补，关闭对话框，将下游引物转变成.seq文件，保存。,PCR反应的全过程,1
30、.高温变性:94下双链DNA通过热变性使其氢键断裂解离成两条单链。2.低温退火：当温度降到引物Tm以下时,引物与模板互补序列杂交。3.中温延伸：当温度升高到72时，模板在dNTP、Taq DNA Polymerase、Mg2+存在下，以引物为起始，沿着5/3/方向延伸。,PCR反应体系的组成,1.10PCR Buffer（Mg 2+plus):100mM Tris-HCl，pH8.3；500mM KCl；0.1%geltin；15mM MgCl2。2.MgCl2:母液15mM或25mM，工作浓度。3.dNTP:母液10mM或2mM，工作浓度200M。4.引物：母液10M或20M，工作浓度M。5
31、.Taq DNA polymerse:1-3U。6.模板DNA：1-500ng。,PCR反应体系,20l反应体系,10PCR Buffer（Mg2+-free）:2lMgCl2(15mM):2ldNTP(10mM):0.3l5/-Primer(10M):0.25l3/-Primer(10M):0.25lDNA模板：10-250ngTaq DNA polymerase:1-2UddH2O:加至 20l,50l反应体系,10PCR Buffer（Mg2+-free）:5lMgCl2(15mM):3ldNTP(10mM):0.6l5/-Primer(10M):0.5l3/-Primer(10M):0
32、.5lDNA模板：10-250ngTaq DNA polymerase:1-2UddH2O:加至 50l,100l反应体系,10PCR Buffer:10lMgCl2(15mM):10l（）dNTP(10mM):10l(各为200)5/-Primer(10M):1l（0.1-0.5）3/-Primer(10M):1l（0.1-0.5）Taq DNA polymerase(5.0U/l）：3-5U基因组DNA模板：10-250ngddH2O:加至 100l,94 2-5min94 30-40s退火温度 1min 25-40cycles72 1-2min72 7-10min4 保存,PCR反应条件
33、,PCR反应条件的选择,1.初变性：945min。2.预变性：9430-45s。3.退火：退火温度（55-72）一般选择比理论Tm低5-10（常用5左右）。4.延伸：一般为70-75（常用72），扩增长度为1-2kb时延伸时间为1min，大于2kb时可适当延长至5-10min，引物长度小于16bp，可采用使延伸温度缓慢上升到70-75，在最后一轮循环后在70-75(72)延伸10min。5.循环数：25-30个循环。,常用的PCR反应条件,94初变性5min，9430s、5530s、721min，25-30个循环，7210min后 4停止反应。,PCR条件的优化,1.Mg2+浓度的优化：范围：
34、0.5mM-10mM。采用二步法优化：第一步0.55.0mM，梯度为0.5mM；第二步梯度为0.2或0.3mM。2.热启动PCR：在第一个循环的温度升高到Tm值后加入Taq酶；使用热激活的Ampli Taq Gold酶；使用含TaqStart Antibody的Taq酶。3.TD-PCR（Touchdown PCR)4.SD-PCR(Stepdown PCR),1.TD-PCR:适用于引物是根据氨基酸序列设计或同源扩增多基因家族成员；退火温度的范围：大于Tm值几度到低于Tm值十几度，跨越15左右。温度降幅为0.5-1，每个温度进行2个循环，最后在低于Tm值10（50）进行10-15个循环。2.
35、SD-PCR：设置7个2一变的步骤或5个3一变的步骤，每个水平的循环数为4。,木奈PPO基因保守区片段的PCR产物,RT-PCR（Reverse Transcription PCR),逆转录反应,逆转录酶,1.AMV（Avian Myeloblastosis Virus)逆转录酶：来源于禽成髓细胞性白血病病毒，最适温度为42，具有RNase H活性，焦磷酸钠会增加其逆转录效率。用量：20U/gRNA。2.MMLV(Moloney Murine Leukemia Virus)逆转录酶：来源于莫洛尼鼠白血病病毒，最适温度为37，具有RNase H活性，焦磷酸钠会降低其逆转录效率。用量：200U/g
36、RNA。Superscrip逆转录酶：无RNase H活性。Mu-MLV逆转录酶。,逆转录的引物,1.Oligo(dT)18 2.六聚体随机引物 3.基因特异引物。,植物目的基因的RT-PCR扩增,逆转录反应：1）先将200l的RNase-free的PCR管中放在冰上按下列顺序加入：RNase-free ddH2O 6lOligo(dT)18(0.5g/l)1 l 总RNA（1.15g/l）5l总体积为12l，总RNA大约为5g，加完后混匀，离心3-5s。2）放70水浴保温5min，放冰上冷却后，离心3-5s，又放回冰上，依次加入：5RT-Buffer 4l 10mMdNTP 2l RNase
37、 inhibitor(20U/l)1l混匀后，离心3-5s，放70水浴保温5min，放冰上冷却后，加入1l M-MLV Reverse Transcritse(200U/l)。3）放42水浴保温60min。4）放冰上冷却后，离心3-5s，放70水浴保温5min，放冰上冷却后，离心3-5s，取5l电泳，120V，20min，其余放-20保存备用。,以cDNA为模板，对基因保守区cDNA进行PCR扩增：50l体系cDNA 2l10PCR Buffer(含Mg2+)5l10mMdNTP 1lHMP P1(10M)2lHMP P2(10M)2l Taq DNA Polymerase(5U/l)0.5l
38、无菌ddH2O 37.5lPCR反应条件：94 2min；30cycles of 94 1min，51 1min，72 1.5min；72 10min；4保存。取10l电泳，120V，20min。,木奈PPO基因保守区cDNA的PCR扩增产物,cDNA末端的快速扩增技术（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）,5/-RACE,5/-RACE引物,5/RACE引物设计,1.GC含量大于50%，退火温度大于58C2.3/端不能以A结尾3.GSP1尽可能靠近poly(A)4.GSP2与GSP3之间的间隔至少大于50bp5.4.GSP2、GSP3与AUAP不能在3
39、/端有4个以上的互补配对6.扩增cDNA全长应在ATG上游设计5/端引物，在终止密码子的下游设计3/端引物7.GSP1、GSP2、GSP3均为反向基因特异引物8.一般两个正向引物AAP与AUAP，AAP与GSP2配对，AUAP与GSP3配对,AAP与AUAP的序列,AAP的序列：5/-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3/。AUAP的序列：5/-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3/。,5/RACE的全过程,cDNA第一链的合成：在PCR管中加入GSP12.5pmol、总RNA1-5g，无RNA酶水加至15.5l，混匀，放70水浴保温5min，放
40、冰上冷却后，离心；依次加入10X PCR buffer 2.5l、25 mM MgCl22.5l、10 mM dNTP mix 1l、0.1 M DTT2.5l总体积为24l混匀，离心；42C保温1min，加入1lSuperScript.II RT，混匀，离心；42C保温1hr；70C 保温15 min，离心；放入37C；加入1 l RNase mix，混匀，离心；37C保温30 min，离心；-20C保存,逆转录产物的纯化预先将bingling solution放室温，将100l无菌水放65C预热；在逆转录产物中加入120l bingling solution（6MNaI)；将混合物转到GL
41、ASSMAXspin cartridge中，13000g离心20s；取出柱子将离心管中的液体转入到新的离心管中保存，将柱子放回到原离心管中；向柱子中加入0.4ml 4C预冷的1X wash buffer，13000g离心20s；去掉液体，重复洗3次；用400l70%乙醇（4C预冷）洗2次，去掉70%乙醇，13000g离心1min；将柱子转移到新的离心管中加入50l 65C预热的无菌水，13000g离心20s洗脱cDNA。,cDNA的加尾反应在离心管中依次加入无RNA酶水6.5l、5X tailing buffer5l、2 mM dCTP2.5l、纯化的cDNA10l，总体积为24l，混匀，离心
42、；放94C保温2-3min，置冰上1min，离心；放冰上，加1 l TdT，混匀，37C 保温10 min；65C 保温10 min，离心。,第一轮PCR：将PCR仪预先调到94C；将0.2ml离心管放冰上，依次加入无菌水31.5l、10X PCR buffer5l、25 mM MgCl23l、10 mM dNTP mix1l、10 M GSP2 2l、Abridged Anchor Primer(10 M)2l、dC-tailed cDNA5l，总体积为49.5l，加入0.5lTaq DNA polymerase(5 U/l)，混匀，离心；PCR反应；取5-20l电泳。,巢式PCR将PCR仪
43、预先调到94C；取5l第一次PCR产物加入到495lTE（pH8.0)中稀释；将0.2ml离心管放冰上，依次加入无菌水31.5l、10X PCR buffer5l、25 mM MgCl23l、10 mM dNTP mix1l、10 M GSP32l、AUAP or UAP(10 M)2l、dilution of primary PCR product5l，总体积为49.5l，加入0.5lTaq DNA polymerase(5 U/l)，混匀，离心；PCR反应；取5-20l电泳。,3-RACE,3-RACE的逆转录,cDNA第一链的合成：在PCR管中加入总RNA1-5g、无RNA酶水加至11l
44、，加入 1l10mM AP，混匀，离心；放70水浴保温10min，放冰上冷却1min，离心；依次加入10X PCR buffer 2.5l、25 mM MgCl22.5l、10 mM dNTP mix 1l、0.1 M DTT2.5l总体积为24l混匀，离心；42C保温2-5min；加入1lSuperScript.II RT，混匀，离心；42C保温50min；70C 保温15 min，离心；放冰上；加入1 l RNase H，混匀，离心；37C保温20 min，离心；-20C保存,3-RACE第一轮PCR,将PCR仪预先调到94C；将0.2ml离心管放冰上，依次加入无菌水36.5l、10X P
45、CR buffer5l、25 mM MgCl23l、10 mM dNTP mix1l、10 M GSP11l、AUAP Primer(10 M)1l、cDNA5l，总体积为49.5l，加入0.5lTaq DNA polymerase(5 U/l)，混匀，离心；PCR反应；取10-20l电泳。GSP1和GSP2为基因正向引物。,巢式PCR,将PCR仪预先调到94C；取5l第一次PCR产物加入到495lTE（pH8.0)中稀释；将0.2ml离心管放冰上，依次加入无菌水36.5l、10X PCR buffer5l、25 mM MgCl23l、10 mM dNTP mix1l、10 M GSP21l、
46、AUAP(10 M)1l、dilution of primary PCR product2l，总体积为49.5l，加入0.5lTaq DNA polymerase(5 U/l)，混匀，离心；PCR反应；取10-20l电泳。,全长cDNA的获得,cDNA第一链的合成：在PCR管中加入0.5g/lOligo(dT)12-181l、总RNA1g、10 mM dNTP mix 1l，无RNA酶水加至12l，混匀，放65水浴保温5min，放冰上冷却后，离心；依次加入5X First-strand Buffer 4l、0.1M DTT2l、1lRNaseOUTTM Recombinant Ribonucl
47、ease Inhibitor(40U/l),混匀，离心；42C保温1min，加入1lSuperScript.II RT(200U/l)，混匀，离心；42C保温50min；70C 保温15 min，离心；放入37C；加入1 l RNase H，混匀，离心；37C保温20 min，离心；-20C保存,全长cDNA的扩增,将PCR仪预先调到94C；将0.2ml离心管放冰上，依次加入无菌水37.5l、10X PCR buffer（含Mg2+)5l、10 mM dNTP mix1l、10 M 上游引物2l、10 M下游引物2l、cDNA2l，总体积为49.5l，加入0.5lTaq DNA polymerase(5 U/l)，混匀，离心；PCR反应；取10-20l电泳。,谢谢各位,
