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1、第六章 植物器官培养,植物器官培养（Organ Culture）是指对植物某一器官的全部、部分或器官原基进行离体培养的技术。分为营养器官（根、茎、叶）和繁殖器官（胚胎、种子、花器官）培养。,第一节 概述,第二节 营养器官培养,一、离体根的培养二、茎尖的培养*三、茎段的培养四、离体叶的培养*,一、离体根的培养（一）意义：生理代谢研究的优良实验体系 研究器官分化形态建成的良好体系 建立快速生长的根无性系 进行诱变育种,1.培养基选择 White培养基；2/3或1/2 MS 和 B5培养基 注：离体根生长要求提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好，加入B1、B6最重要，生长素对离体根影响不一致。培养温
2、度2527，暗光培养。,（二）培养方法,2.无性繁殖系的建立 种子消毒 接种待根伸长后从根尖一端切取长1.2cm的根尖接种于培养基发育出侧根待侧根生长约1周后切取侧根的根尖进行扩大培养又迅速生长并长出侧根切下进行培养，如此反复得到从单个根尖衍生而来的离体根的无性系。3.培养条件 暗光和温度25-27。,二、茎尖的培养*,（一）茎尖培养概念及类型（二）病毒在植物体内的分布（三）茎尖培养方法及步骤,(一)茎尖培养概念及类型 茎尖培养：切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行无菌培养。茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为：微茎尖培养:带有1-2个叶原基的生长点,其长度不超过 0.5mm。,普通茎尖培
3、养：较大的茎尖(如几mm到几十mm)、芽尖及侧芽。这里主要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作方便，茎尖容易成活，成苗所需时间短。茎尖培养的意义：普通茎尖培养技术简单，操作方便，易成活，成苗 时间短，加快繁殖。微茎尖培养可获得脱毒苗；,病毒侵染植株的叶片后，经过一段时间，即向附近的细胞增殖转移。转移速度很慢，每小时只有几微米。当叶片内病毒浓度增大到一定量时，就转移到韧皮部，随后通过维管束转移到其它部分。由于病毒转移速度慢，加上茎尖分生组织无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以生长点的病毒数量极少，几乎检测不出。茎尖培养时，切取的茎尖越小，带病毒的可能性就越小。茎
4、尖脱毒的基本原理,(二)病毒在植物体内的分布,（三）茎尖培养方法及步骤,直接取材：在生长旺盛、枝条健壮、无病的母株上选生长不久、杂菌污染少的顶梢（12cm）（取前可喷杀菌药，可顶芽或侧芽）。从试管苗获取。,1、取材,取1-2顶梢,2、材料处理及消毒,将采集到的茎尖切成长去叶（休眠芽预先剥除鳞片）流水冲洗2-4h 75的酒精中处理30s 稀释20倍的次氯酸钠中浸5-8min(取自老枝条上的可适当延长时间）用无菌水冲洗数次，准备接种。,3、接种 接种前再剥掉一些叶片，使茎尖0.5cm 接种 要求：随切随接，动作迅速。亦可将切下茎尖材 料在15%VC液中浸一下。,4、培养的方法和程序（1）培养基 基
5、本培养基 MS、White、B5、Heller培养基。蔗糖作碳源效果好，浓度23%。激素（2，4-D，IAA，NAA）和有机添加物有明显影响。但激素浓度以0.1mg/L为宜，不要太高。,生长太慢：茎尖不增大变绿细胞逐渐老化休眠 原因:生长素浓度太低；温度过低或过高；生长太快：茎尖迅速增大愈伤组织丧失成苗能力 原因:生长素浓度过高；光照太弱或温度太高；生长正常：茎尖基部稍增大并形成少量愈伤组织，茎尖颜色 逐渐变绿，并伸长，叶原基发育成可见的小叶，进而形成小苗。,茎尖生长状态,（2）初代培养条件 每天 光照16h，光强度1500-30001x，温度252,（3）继代培养 茎尖长成的新梢切成小段增殖
6、培养基中 1个月左右新梢又可切成小段再转入新培养基建立和维持了茎尖无性系。（即微型扦插）继代培养可用MS培养基。,（4）诱导生根 采用12MS培养基 加入一定的生长素类调节物质，如NAA、IBA等。新梢基部浸入50或100mg/l的IBA溶液处理4-8h，然后转移到无激素的生根培养基中。,(5)驯化移栽入土 在生根培养1个月左右生长健壮而发达的根系炼苗移栽 管理（温、光、湿、气）,指不带芽和带一个以上定芽或不定芽（包括块茎、球茎在内）的幼茎切段的无菌培养。,三、茎段培养,（一）定义：离体叶培养指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。它大多经脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织分
7、化出茎和根。其中叶片培养是一个典型的代表。,四、离体叶的培养*,（二）意义：1.是繁殖稀有名贵品种的有效手段；2.可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题。,（三）叶片的离体培养方法 发育方式：叶片培养再生成完整植株有两种方式：是直接诱导形成芽和根完整植株；是先诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织分化形成芽和根完整植株。其中，以第二种方式最为常见。,叶片离体培养发育方式（成苗途径）,叶原基,叶鞘,叶片,子叶,叶柄,愈伤组织,芽和根,试管苗,不定芽,1.材料选择及灭菌 取植物的幼嫩叶片，切割成适当大小（23cm），在流水中冲洗干净。再用70酒精浸泡约10s 饱和漂白粉液中浸3-15min，或
8、在0.1升汞中浸3-5min 无菌水冲洗数次无菌的干滤纸上吸干水分接种。注：细嫩与成熟叶片消毒时间不同,2.接种 外植体大小：0.5cm2 薄片（叶柄、子叶）上表皮朝上接种培养基。最好带叶脉，注意极性,3.培养（1）培养基：MS、B5、White、N6；蔗糖3%；2.4D利于愈伤组织形成，NAA抑制芽形成，利于根发生，KT、6-BA利于芽形成。愈伤组织诱导：BA 1-3mg/L,NAA 0.25-1mg/L；分化培养：CTK 2 mg/L；生根培养：NAA 0.51.0 mg/L,(2)培养过程：培养约2周至4周形成愈伤组织再分化培养基上（附加6-BA 2mgL）进行分化培养约10d左右，愈伤
9、组织开始转绿出现绿色芽点发育成无根苗生根培养基（附加 NAA0.5-l mg/L）发育形成完整植株。,(3)培养条件：温度：252 光照时间：10-12h，光照强度：1500-3000 Lx。,叶的培养比胚，茎尖和茎段培养难度大。首先要选用易培养成功的叶组织，如幼叶比成熟叶易培养，子叶比叶片易培养。其次要添加适当的生长素和细胞分裂素，保证利于叶组织的脱分化和再分化。,第三节 生殖器官的培养,一、花器官的培养二、种子的培养三、胚胎的培养*,一、花器官的培养,1.定义：花器官培养指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。,一、花器官的培养（花蕾）,2、意义：通过离体花
10、芽培养可了解整体植物和内源激素在花芽性别决定中所起的作用 可以了解花器各部分对果实和种子发育的作用 内、外源激素在果实种子发育过程中的调控作用 生产上也可用于珍贵品种的扩大繁殖。,二、种子培养,定义：种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的未成熟种子的无菌培养。,2.意义：可以打破种子休眠，促进萌发；通过胚胎拯救解决远缘杂种败育性，产生后代；快速繁殖苗木 优点：植株分化容易，无菌操作方便,定义：植物胚胎培养是指对植物的胚(幼胚、成熟胚)、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。,三、胚胎的培养*,胚胎培养已有近百年的历史：1904年的Haning最早成功地培养了萝卜和
11、辣椒的胚，并萌发形成小苗。30年代成功地把兰科植物的胚培养成小植株。40年代在苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、甘蓝与大白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养及子房与胚珠培养均取得了不同程度的进展,（一）胚胎培养的意义克服远缘杂种的不育性；使胚发育不全的植物获得后代；缩短育种年限；研究与胚发育有关的内外因素。,（二）离体胚培养 离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，一般可分为成熟胚和幼胚培养。,1.成熟胚培养 指子叶期后至发育完全的胚。培养较易成功，在含有大量无机元素和糖的基本培养基上，就能正常生长成幼苗。将成熟或未成熟种子用70酒精进行几秒钟的表面消毒无菌水冲洗3-4次无菌条件下进行
12、解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养。,培养基：White Tukey MS无机盐+糖(1-2%)+生长辅助物质(激素、AA、活性炭、维生素等),幼胚是指子叶期以前的幼小胚。由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，其研究应用越来越深入广泛。幼胚培养技术：心形期胚或更早期的胚（长度仅0.10.2mm）胚越小就越难培养,幼胚培养成功的有大麦、荠菜、甘蔗、甜菜、胡萝卜等,2.幼胚（未成熟胚）培养：,（1）未成熟胚胎的培养有三种不同的发育方式：a.继续进行正常的胚胎发育，维持“胚性生长”；b.早熟萌发，即培养后迅速萌发成幼苗；c.胚在培养基中发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体
13、或芽原基。,（2）幼胚培养技术幼胚培养的操作方法与成熟胚培养方法基本相同。值得注意的是切取幼胚必须在高倍解剖镜下进行，操作时要细心，尽量取出完整的胚。幼胚培养成功的关键，是提供幼胚所必需的营养和环境条件。,培养基 幼胚对培养基要求较高，常用的培养基有Tukey，Nitch、MS，B5培养基；,通常存在的影响条件如下：,生长调节物质 不同植物的胚培养需要的生长物质不同。如IAA可明显促进向日葵胚的生长；IAA，Kt的共同作用可促进荠菜幼胚的生长；一般认为IAA可使胚的长度增加；加入BA可提高胚的生存机会；,天然提取物的作用 椰乳对胚培养有一定的促进作用（番茄胚在含有50%椰乳的培养基中可维持生长
14、）一些瓜类的胚乳提取物能促进胚生长的能力。,温光条件 对于大多数植物的胚来说，在25-30为宜 早熟果树如桃的种胚，必须经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长，而马铃薯胚以20为好。光照可以促进某些植物胚的转绿，利于胚芽生长，而黑暗则利于胚根生长。因此以光暗交替培养较为有利。,其它条件 胚培养中除要求较高的蔗糖（4.5%）浓度、高渗透压以外，还要求较高浓度的氨基酸及无机盐。,(三)胚珠培养,.定义：胚珠培养是将授粉的子房在无菌条件下解剖后，取胚珠置于培养基培养的过程。有时也把胚珠连同胎座一起取下来培养。,花组成,2.意义：胚珠培养可以解决象兰科植物成熟胚较小不易培养的问题。另一方面在未受精的胚
15、珠培养中，可诱发大孢子发育成单倍体，用于单倍体育种。,3.培养技术：从花中取出子房 70%酒精消毒30秒 无菌水冲洗 5%次氯酸钠液中灭菌10分钟 无菌水冲洗数次 在无菌条件下进行解剖 取出胚珠 放在培养基上 培养 基本培养基：用Nistch培养基 MS、N6、B5等培养基也可采用 关键：选择胚的发育时期球形胚期的胚珠较易培养成功,4.发育方式：,(四)子房培养,1.取材：开花前15天摘下未授粉子房；或授粉后摘下子房。2.灭菌：材料处理(禾谷类植物用70%酒精擦洗幼穗；双子叶植物花蕾用饱和漂白粉灭菌15分)70%浸30秒 无菌水冲洗 0.1%升汞1520分钟 无菌水冲洗 无菌滤纸吸干。,3.接
16、种：无菌条件下剥开幼花，夹出子房并接种于培养基（MS、N6等）。4.培养：温度26,相对湿度50-60%，16h散射光。,胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的三倍体组织。由它可获得无子结实的三倍体植株，进而可将它加倍成六倍体植株。,(五)胚乳的培养,培养方法：1.取材与接种 取授粉4-8d后的幼果常规消毒在无菌条件下切开果实 取出种子 分离出胚乳 接种 2.培养基:MS、White+2，4-D（）,3.培养 在25-27和黑暗条件或散射光下培养约6-l0d胚乳开始膨大形成愈伤组织分化培养基上（附加6-BA 及少量的NAA）培养 待愈伤组织长出芽后，切下不定芽生根培养基光下培养10-15d，切口处可长出白色的不定根。,
