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1、第二节 DNA连接酶（DNA ligase）,一、DNA连接酶的作用,1、修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键,2、修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键,3、连接多个平头双链DNA分子,（1）DNA连接酶只能连接相邻核苷酸之间的切刻（nick）；（2）如果是缺少一个或几个核苷酸的裂口（gap），DNA连接酶是无法连接的；,注 意,（3）DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分；（4）DNA连接酶催化的连接反应是需要能量的：在大肠杆菌或其他细菌中，利用NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），在动物细胞中及噬菌体中，利用ATP
2、（腺苷三磷酸）。,注 意,T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶,二、DNA连接酶的种类,T4噬菌体DNA连接酶,该酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，是T4噬菌体基因30编码的产物，分子量为68ku，需要ATP作为辅助因子。,两个带有互补粘性末端的双链DNA分子一条带有切刻的双链DNA分子两个带有平头末端的双链DNA分子DNA-RNA杂合体分子中切刻,该酶可连接,大肠杆菌DNA连接酶,该酶是从正常的大肠杆菌中提取的，由大肠杆菌基因组中lig基因编码，分子量为75ku，需要NAD+作为辅助因子。,具有同源互补粘性末端的不同DNA分子 一条带有切刻的双链DNA分子,该酶可连接,但该
3、酶几乎不能催化两个平头末端DNA分子的连接,T4噬菌体DNA连接酶：该酶在DNA体外重组中比大肠杆菌DNA连接酶应用广泛(既能连接粘性末端,也能连接平头末端)。,两种酶各自的优点,大肠杆菌DNA连接酶：该酶的连接产物转化细菌后，假阳性背景低(由于它对DNA末端的要求比较严格-互补粘性末端)。,两种DNA连接酶的比较,三、DNA连接酶的反应体系,DNA酶的连接作用过程,1、辅助因子ATP（或NAD+）提供的激活AMP，与连接酶形成共价结合的酶-AMP复合物（腺苷酰酶）；同时释放出焦磷酸（PPi）或烟酰胺单核苷酸NMN。2、激活的AMP转移到DNA一条链的5-末端磷酸基团上形成DNA-腺苷酸复合物
4、。3、3-OH末端对活跃的磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键将缺口封起来，同时释放出AMP。,酶AMP复合物,DNA 腺苷酸复合物,四、影响连接反应的因素,1、DNA浓度：插入片段：载体分子的摩尔比=3：1较好，一般在2-20 nmol/L 2、反应时间与温度：温度一般在4-16间，常用12-1630min-16h 黏末端：20，30min；20，60min（有氢键）平末端：可使用较高温度（无氢键）,3、连接酶的用量：粘末端：0.1 U/g DNA 平末端：1-2 U/g DNA4、其他干扰因素如EDTA、杂蛋白质、存留有活性的酶等影响酶切的因素也影响连接效果。5、ATP浓度：最适0.5mmol
5、-1mmol/L,四、影响连接反应的因素,第三节 DNA聚合酶（DNA polymerase）,DNA聚合酶指的是在DNA(或RNA)模板指导下，以4种dNTP为底物，在引物3-OH末端聚合DNA链的一类酶。,特点：需模板(DNA或RNA)需有带3-OH末端的引物 聚合方向53 同时具有35和外切53外切活性,定 义,目前已开发的DNA聚合酶,DNA聚合酶(全酶)(E.coli)Klenow片段(E.coli)TDNA聚合酶TDNA聚合酶Taq DNA聚合酶(耐热)DNA末端转移酶(小牛胸腺)反转录酶(依赖RNA)聚合酶,依赖DNA的DNA聚合酶,不依赖DNA的DNA聚合酶,依赖RNA的DNA
6、聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶,1、DNA聚合酶的分类,目前，从大肠杆菌中已分离出3种DNA聚合酶，分别为：,分子克隆中常用DNA聚合酶,2、大肠杆菌DNA聚合酶的性质,大肠杆菌DNA聚合酶是Kronberg等1956年发现的第一个DNA聚合酶，故也称为Kronberg酶。,5 3DNA聚合酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶(DNApol)发挥聚合酶活性需要:DNA模板、引物、dNTP和Mg2+。,2、大肠杆菌DNA聚合酶的性质,该活性识别单链，能将复制过程中3端的错配碱基切除，从而保证DNA复制的高保真度，也称为校对功能。,DNApol,5,3,5,2、大肠杆菌DNA聚合酶的性质,5 3外切核酸酶活
7、性的水解作用有3个特征：待切除的核酸分子必须具有5端磷酸基团。核苷酸分子被切除前位于已配对的DNA双螺 旋区段上。被切除的核苷酸既可以是DNA也可以是RNA.,3、大肠杆菌DNA聚合酶的用途,在DNA聚合反应体系中，如果加入放射性核素标记的核苷酸，则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子，这就是所谓的DNA分子杂交探针。,标记,核酸探针（probe）,能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。,用DNA聚合酶I 制备探针,已知序列的核酸片断,显示位置,与互补的待测序列杂交,标记,已知序列的核酸片断,探针的标记方式,标记,已知序列的核酸片断,带有放射
8、性的已知序列的核酸片断,5,3,杂交探针的制备过程,3,切刻平移反应原理,切口转移法(nick translation),通常所用的Klenow片段是由枯草杆菌蛋白酶切割完整的DNA聚合酶片段而成，或是经过克隆产生的一条多肽链(Mr=76 kDa)。,Klenow 片段,1、Klenow 片段的由来,Klenow 片段,1、Klenow 片段的由来,Klenow 片段,2、Klenow 片段的用途,填补由DNA限制酶反应产生的凹陷3末端。DNA分子的末端标记。在cDNA克隆出来后，合成cDNA第二条链。用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA序列分 析等。,3端补平,5,5,klenow,D
9、NA 3末端标记,补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。,在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。,klenow,主要用途,3隐蔽末端的DNA片断,Klenow fragment补平,根据末端的顺序选择一种-32P-dNTPs,末端标记的DNA,限制性内切酶切,5-G3 3-CTTAA5,5-GAA3 3-CTTAA5,5-GAATT3 3-CTTAA5,5-G3 3-CCTAG5,5-GG3 3-CCTAG5,5-GGATC3 3-CCTAG5,EcoR I,BamH I,-32P-dATP,-32P-dGTP,25oC 1h,cDNA第二链的合成,mRNA,cDNA第一链,逆转录,cDNA第二链
10、,klenow,5,3,3,5,5,3,引物,T4 DNA聚合酶,1、T4 DNA聚合酶的性质,T4 DNA聚合酶的外切酶活性比Klenow片段高1001000倍,与Klenow片段不同,具有5 3聚合酶活性具有3 5外切酶活性,与Klenow片段相同,不具有5 3外切酶活性,T4 DNA聚合酶,2、T4 DNA聚合酶的用途,填补或标记由限制酶切割DNA后产生的凹陷3末端，标记反应时需要高浓度的dNTP，以保证聚合反应（填补）大于3 5核酸外切酶活性。进行3突出末端的DNA末端标记。,T4DNA聚合酶,2、T4 DNA聚合酶的用途,标记用作杂交探针的DNA片段。由3 5核酸外切酶活性部分酶切双
11、链DNA，得到凹缺3末端用32PdNTP填补（取代合成）。,将双链DNA的末端转化成平头末端。利用T4DNA聚合酶的3 5核酸外切酶活性从双链DNA上切除突出3末端，在高浓度dNTP中模板上双链区的降解与合成达到平衡。,5,5,3,3,5,5,3,3,T4 DNA聚合酶,无dNTPs,T4 DNA聚合酶,有dNTPs,5,5,酶切中间产生两个末端标记,加入某种32P-dNTP和dNTPs,T4 DNA聚合酶（35外切）,DNA酶切片断,T4 DNA聚合酶（53聚合）,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,内切酶切,无dNTPs,T7 噬菌体 DNA 聚
12、合酶,来源：T7噬菌体感染的E.coli,结构：由2个蛋白亚基组成：T7噬菌体基因5编码的蛋白和宿主细胞的硫氧还蛋白,活性：53聚合，在所有DNA聚合酶中持续反应时间最长，所以合成的DNA链较长，在DNA测序中有很大优越性；35外切活性（由 T噬菌体基因5编码，是Klenow酶的 1000倍）,用 途,复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列,与TDNA pol一样，平齐粘性末端。,定点突变中互补链的合成。,用填补或交换反应快速进行末端标记。,修饰的T7 DNA聚合酶测序酶（Sequenase）,测序酶是美国 United States Biochemical 公司改造的 T7 噬菌体 DNA
13、 聚合酶，切除了 99%以上的 3-5外切活性。改进的Sequenase 2.0则切除了所有的 3-5 外切活性，是用双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。,Taq DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶最初是从耐热细菌Thermusaqraticus中纯化而得，因此是一种单亚基耐热的依赖DNA的DNA聚合酶，现已广泛用于基因工程的操作中。,1、来源,Taq DNA聚合酶,具有5 3聚合酶活性最适反应温度为7580（据目的序列不 同而不同）Taq DNA聚合酶在60时其聚合酶活性下降2倍，在37时下降10倍。,2、性质,Taq DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应（PCR）
14、，在体外扩增特定的DNA片段，DNA或单链cDNA都可作为起始模板。但在使用中应注意：Taq DNA聚合酶需要Mg2+。磷酸缓冲液抑制该酶活性，应避免使用。,3、用途,逆转录酶,1、一般知识,逆转录酶的特性与转录酶的活性完全不同，实际上它是DNA聚合酶的一种，又称依赖于RNA的DNA聚合酶、RNA指导的DNA聚合酶、RNA肿瘤病毒的DNA聚合酶。分子量约为16万，由分子量分别为6.2万和9.5万的两个结构相关的亚单位组成。,逆转录酶,2、来源,逆转录酶最主要的来源是鸟类成髓细胞性白血病病毒（AMV）。,3、特性,AMV逆转录酶的活性首先表现为DNA聚合酶的活性。,模板既可以是DNA，也可以是R
15、NA，在以RNA为模板是称为RNA指导的DNA聚合酶活性，而以DNA为模板是则叫做DNA为指导的DNA聚合酶。.,逆转录酶,3、特性,AMV逆转录酶的活性其次表现为RNaseH活性。此酶可以特异性降解RNA-DNA杂种双链中的RNA部分。另外，还具有DNA内切酶活性和核酸结合活性。,逆转录酶,4、用途,逆转录酶在基因工程中可用于cDNA的合成。即可将任何真核基因的mRNA经反转录形成cDNA拷贝，然后构建克隆，大量扩增，并表达这种基因，从而为真核基因的研究与其核遗传工程提供了一项必不可少的手段。,1、性质,来源于小牛胸腺。催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3-OH末端。这与DNA聚合酶通过5 3
16、聚合5-脱氧核苷三磷酸合成一条DNA链过程相似。所不同的是末端转移酶不需要模板。,末端转移酶,2、用途,进行DNA 3-OH末端标记。标记物可以是放射性的，如-32P-dNTP,也可以是非放射性的,如生物素-11-dUTP,它们可用于DNA序列分析、DNase足迹分析、分子杂交等实验中。,2、用途,进行同聚物接尾：主要是给载体和外源DNA分别加上互补的同聚物尾巴，以便二者在体外连接。用末端转移酶给一群DNA分子3-OH末端接上oligo（dA）或（dG），给另一群DNA分子3-OH末端接上oligo（dT）或（dC），混合这两群分子，就能使末端转移酶接上的同聚物尾部退火形成环状分子。这种方法称
17、为同聚物接尾法。,第四节 核酸酶,核酸酶,核酸酶是一类能降解核酸的水解酶，它在基因工程操作中应用非常广泛。根据核酸酶对底物作用的专一性，可将其分为三类：,核糖核酸酶（RNase）：只作用于RNA。,脱氧核糖核酸酶（DNase）：只作用于DNA。,核酸酶（nuclease）：既作用于DNA，又 作用于RNA。,ds-DNA结构:切口,缺口,断口,一、核酸外切酶,exo是一种促加工的单链核酸外切酶，它能够从5末端或3末端降解DNA分子，产生出寡核苷酸短片段，且不需要Mg2+的参与。,（一）核酸外切酶（exo）,（二）核酸外切酶（exo）,该酶可以从双链DNA的3-OH末端起逐一切去5单核酸，其作用
18、底物为含切口或缺口的线性双链DNA和开环DNA。作用后在双链DNA上形成一条长的单链区，这种外切酶不能降解单链DNA和带突出3末端的双链DNA。,（二）核酸外切酶（exo）,（三）核酸外切酶（exo）,53外切。,主要用途：,使DNA双链变成单链、进行序列分析；除去5-端突起，产生3-端突起，便于加尾,5 P-,-P 5,5,5,exo,成为测序模板,识别5-P（但不能降解5-OH）,（四）T7基因6核酸外切酶,53外切。,用途与 exo一样。,既能识别5-P，又能识别5-OH。,5,5,5,5,已被克隆到大肠杆菌中表达。,（一）核酸酶S1,核酸酶S1是从米粉状曲菌（Aspergillus o
19、ryzae）提取带的一种金属蛋白，分子量32,000，相对耐热，催化反应通常需要Zn2+和酸性条件，产生带5磷酸的寡核苷酸。,1、来源,二、核酸内切酶,2、特性,降解单链DNA或RNA，包括双链分子中的单链区域(如发夹结构)，这种单链区域甚至可以小到1个碱基对的程度。降解单链DNA的速度比RNA的速度快10倍。降解反应的方式为内切和外切。降解反应的最适pH为4.04.5。酶量过大时，伴有双链核酸的降解，该酶的双链降解活性仅为单链的1/75,000。,核酸酶S1的基本反应：内切单链DNA或RNA,核酸酶S1的基本反应：内切带切刻或缺口的双链DNA,3、用途（在DNA上定位RNA）,（二）Bal
20、31核酸酶,1.来源,埃氏交替单胞菌（Alteromonoas espejiana）,2.功能,既有单链特异的DNA（RNA）内切酶活性；又有双链特异的DNA外切酶活性。,降解双链DNA或其上的单链缺口、未配对的单链区域。,4.Bal31的用途,定位测定DNA片断中的限制酶位点分布。,3.反应条件,需要Mg2+、Ca2+,EGTA（乙二醇双四乙酸）专一性螯合Ca2+，可终止反应，不影响Mg2+，也不影响限制性内切酶活性。,EcoR I,EcoR I,BamH I,Hind III,EcoR I,EcoR I,BamH I,Hind III,分别用各个内切酶切后电泳，记录片断数目和大小。,Eco
21、R I,BamH I,Hind III,Marker,（三）RNA酶A,RNA酶A是一种RNA限制酶，专一性地作用于单链RNA的3端嘧啶残基，切开其与邻近核苷酸相连的磷脂键。产物为带3-P的嘧啶和末端为3-P嘧啶的寡核苷酸。,从DNA-RNA中切除未杂交的RNA区；图谱分析DNA或RNA上单碱基突变体；确定RNA序列中胞嘧啶的位置进行RNA测序。,用途,（四）RNA酶H,该酶也为RNA限制酶，可水解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，产生5-P核苷酸。,cDNA第一条链合成的过程中除去RNA-DNA杂交分子中的RNA链或进行第二条链合成前切割RNA引物.检测RNA-DNA杂合体；通过与寡聚dT杂交，从mRNA中除去多聚A序列.特异性地切割与寡脱氧核苷酸结合的RNA。,用途,（五）RNA酶T,RNA酶T是一种RNA限制酶，特异性地作用于鸟嘌呤核苷酸的3磷酸基团，切割与其邻近核苷酸相连的5磷酸键，最终产物为3磷酸鸟嘌呤和带3磷酸鸟嘌呤末端的寡核苷酸。,从DNA-RNA杂合体上切除非杂交的RNA区；用于RNA序列分析和指纹图谱分析中。,用途,
