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1、2023/8/19,1,发酵工业分析,第四章 比色分析与分光光度分析,2023/8/19,2,比色法的发展,比色法(colorimetry)是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法.（1）早在公元初古希腊人就曾用五倍子溶液测定醋中的铁。（2）1795年，俄国人也用五倍子的酒精溶液测定矿泉水中的铁。（3）比色法作为一种定量分析的方法，大约开始于19世纪3040年代。（4）20 世纪3060年代，是比色法发展的旺盛时期，此后就逐渐为分光光度法所代替。,2023/8/19,3,第一节 概 述,1 光度分析法的特点 2 物质对光的选择性吸收3 光吸收的基本定律4 常用仪器 5 显色
2、反应及显色条件的选择6 影响比色与分光光度分析的因素,2023/8/19,4,1 光度分析法的特点,有色物质颜色的深浅和浓度有关，利用比较溶液颜色深浅来测定含量的分析方法称为比色分析法。目视比色称为比色法；利用分光光度计测试，称为分光光度法。光度分析法特点：(1)具有较高的灵敏度。一般物质可测到10-310-6 molL-1(2)有一定的准确度。相对误差为2%5%(3)操作简便、快速，选择性好，仪器设备简单。(4)应用广泛。,2023/8/19,5,2 物质对光的选择性吸收,在可见光区(400760nm)不同波长的光具有不同的颜色。溶液呈现一定的颜色是对光选择性吸收的结果。当一束白光通过一有色
3、溶液时，某些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过，溶液的颜色由透过光决定。透射光与吸收光又可组成白光，这两种光称为互补色光。,2023/8/19,6,如CuSO4溶液呈蓝色就是吸收了白光中黄光。,2023/8/19,7,如果将不同波长的光通过一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度（吸光度A），然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得一曲线，称吸收曲线。,2023/8/19,8,图中、三条曲线，代表同一被测物质含量由高到低的吸收曲线。,邻二氮杂菲亚铁溶液的吸收曲线,2023/8/19,9,（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收
4、波长max（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，max不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max则不同。（3）在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,2023/8/19,10,3 光吸收的基本吸收定律,（1）朗伯-比尔定律（2）吸光度的加和性（3）对朗伯-比尔定律的偏离,2023/8/19,11,（1）朗伯-比尔定律,当一束平行的单色光通过均匀、透明的有色溶液时，如溶液的浓度越大、液层厚度越大，则光强度的减弱越显著。,I0：入射光强度；It：透射光强度,“A”称为吸光度，量纲为1。溶液对光的吸收程度越大，则透射光强度
5、越小，A越大。,2023/8/19,12,吸光度测量中，也用透光度T表示,透过光强度越大，T值越大。,2023/8/19,13,b：液层的厚度 cm；c：溶液的浓度 gL-1K：吸光系数 L g-1 cm-1如“c”的单位：molL-1，此时的吸光系数称为摩尔吸光系数 k,k：摩尔吸光系数 L mol-1 cm-1,式中M为摩尔质量,2023/8/19,14,k 是吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。在温度和波长等条件一定时，k 仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关。k 是吸光物质吸光能力的量度，k 值越大，光度法测定该物质的灵敏度越高。由实验结果计算时，常以被测物质的总浓度代替
6、吸光物质的浓度，这样计算的 k 值实际上是表观摩尔吸光系数。,2023/8/19,15,例：已知含Fe2+浓度为1.0mgL-1的溶液，用邻二氮菲光度法测定铁(Fe2+与邻二氮菲反应，生成橙红色配合物)。使用厚度为2 cm的吸收池，在波长510nm处测得 吸光度A=0.390。计算该配合物的 摩尔吸光系数。解：已知铁的相对原子质量为 55.85。,2023/8/19,16,（2）吸光度的加和性,在含有多组分的体系中，若各组分对同一波长的光都有吸光作用，且各组分的吸光物质彼此不发生作用，则测得的吸光度等于各组分的吸光度之和。A=A1+A2+A3,2023/8/19,17,（3）对朗伯-比尔定律的
7、偏离,比尔定律的局限性非单色入射光引起的偏离 由于溶液本身发生化学变化的原因引起的偏离,2023/8/19,18,比尔定律的局限性,通常在用分光光度法进行分析时，多采用标准工作曲线法。即固定液层厚度、入射光的波长，测定一系列不同浓度标准溶液的吸光度，此时A与c应成直线关系。,在实际工作上，特别是在浓度较高时，常出现标准曲线不为直线，即偏离了朗伯比尔定律。,2023/8/19,19,比尔定律是一个有限制性的定律，它假设入射光为单色光，吸收粒子间没有干扰。因此仅在稀溶液中才适用。在高浓度时，由于吸光物质微粒间相互影响，从而改变了它对光的吸收能力，使吸光度与浓度的线性关系发生偏离。,2023/8/1
8、9,20,非单色光引起的偏离,比尔定律假设入射光为单色光，但是目前仪器所能提供的入射光不是严格的单色光，是由波长范围较窄的光带组成的复合光。A=k b c，k 在一定波长下是一常数，如入射光不为单色光，则k不为常数，A 与c 不成直线关系。,2023/8/19,21,在最大吸收波长附近通常有一个吸收强度相差较小的区域，如入射光在此范围内，因k 变化较小，引起的偏离也较小，A与c基本上呈直线关系。,2023/8/19,22,由于溶液本身发生化学变化 的原因引起的偏离,由于被测物质在溶液中发生缔合、离解或溶剂化、互变异构、配合物的逐级形成等化学因素，造成对比耳定律的偏离。Cr2O72-+H2O 2
9、CrO42-+2H+,橙色,黄色,应控制条件，使溶液中仅存在Cr2O72-或CrO42-，这样，c与A 之间才成直线,2023/8/19,23,4 比色法和分光光度法及其仪器,目视比色法与光电比色法 分光光度计的基本部件常用的几种分光光度计,2023/8/19,24,目视比色法,目视比色法是一种用眼睛辨别溶液颜色的深浅，以确定带测组分含量的方法。常用标准系列法，在一套等体积的比色管中，加入不同体积的标准溶液，分别加入等量显色剂及其它试剂，待测液在同样条件下显色。稀释至刻度，摇匀。比较待测液和标准色阶溶液的颜色深浅，确定待测液的浓度。目视比色法仪器简单，操作简便，但准确度较差。,2023/8/1
10、9,25,光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。,2023/8/19,26,光电比色法与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片和参比溶液来消除干扰，从而提高了选择性。,2023/8/19,27,分光光度计的基本部件,a.光源 作用：发出所需波长范围内的连续光谱。要求具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区常用钨灯、或碘钨灯，波长范围：3202500 nm,2023/8/19,28,b.单色器 作用：将光源发出的连续光谱分解为单
11、色光。单色器由棱镜和光栅等色散元件及狭缝和透镜组成。入射狭缝：光源的光由此进入单色器；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；出射狭缝。,2023/8/19,29,c.吸收池作用：用于盛放试样溶液。也叫比色皿。吸收池主要有石英和玻璃两种。在紫外区须采用石英吸收池，可见区一般用玻璃吸收池。吸收池大多是长方形的，一般仪器都配有一套厚度为0.5、1、2、3cm的吸收池。吸收池放置的位置应使透光面垂直于光束方向。,2023/8/19,30,d.检测系统作用：将光强度转化为电流进行测量。光电转换
12、器对测定波长范围内的光有快速灵敏的响应，产生的电流应与光电转换器上的光强度成正比。常用的光电转换器有硒光电池、光电管。e.读数指示器作用：把光电流或放大的信号以适当的方式显示或记录下来。,2023/8/19,31,常用的几种分光光度计,72型、722型、751型等。,2023/8/19,32,比色分析是否等同于分光光度分析？,光电比色计和紫外可见分光光度计的光路结构非常相似，它们之间不同的地方在于：分光光度计采用棱镜或光栅作色散元件，因而可以得到纯度较高的单色光束。而光电比色计采用滤光片，只能得到一定波长范围的光谱带(复合光)；,2023/8/19,33,紫外可见分光光度计采用紫外和可见区的光
13、源，即氢灯和钨灯，而光电比色计只用一种钨灯光源，因而前者适用于紫外可见光谱区，而后者只适用于可见光谱区；,2023/8/19,34,紫外可见分光光度计可以测定待测组分的精细吸收光谱，不仅可用于定量分析，而且可以作有机化合物的定性和结构分析，而光电比色计只能作定量分析；,2023/8/19,35,分光光度计一般都采用灵敏度高的光电倍增管作检测器，而光电比色计一般用光电池或光电管作检测器。因此，光电比色计无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外可见分光光度计。,2023/8/19,36,比色法是以生成有色化合物的显色反应为基础的，一般包括两个步骤：首先是选择适当的显色试剂与待测组分反应，形
14、成有色化合物，然后再比较或测量有色化合物的颜色深度。,反应,显色剂+待测组分,测定颜色深浅,显色反应尤为重要,5 显色反应及显色条件的选择,2023/8/19,37,（1）对显色反应的要求,将待测组分转化为有色化合物的反应叫显色反应。显色反应有配位反应和氧化还原反应。1.灵敏度高 因为光度法一般用于测定微量组分含量，故通常选择灵敏度高的显色反应。生成的有色化合物摩尔吸光系数大，灵敏度高，通常 k 值达104105，认为灵敏度较高。2.选择性好 即显色剂只与一种或少数几种物质反应而显色。3.有色化合物组成固定，化学性质稳定 4.显色剂在测定波长处无明显吸收,2023/8/19,38,（2）显色反
15、应条件的选择,a显色剂的用量 通常显色反应可用下式表示：M(被测离子)+HR(显色剂)MR+H+,从平衡角度看，显色剂过量越多，越有利于有色配合物的形成。但显色剂过量太多，有时会引起副反应，故有一适宜用量，通常由实验确定。,固定其它条件，改变显色剂的浓度，测A，作A c R曲线，选择原则：选择曲线上平坦部分,2023/8/19,39,(a)适合进行光度分析(对显色剂浓度控制不严格)(b)只能选择较窄的显色剂浓度范围(c)必须严格控制显色剂浓度。,2023/8/19,40,b.酸度 酸度对显色反应的影响是多方面的：H+浓度大，不利于有色配合物的形成；酸度还影响有些显色剂的颜色；某些被测组分与显色
16、剂能形成不同组成的配合物；金属离子在酸度下降时会水解。适宜的酸度范围由实验确定：固定其它条件，改变pH值测A，作A pH曲线，选择曲线平坦部分对应的pH值作为测量条件。,2023/8/19,41,吸光度与pH关系曲线,2023/8/19,42,c显色时的温度和时间 多数显色反应在室温下能很快进行，有些反应需要加热。多数显色反应须经一定时间才能完成，有些有色物质放置时受到空气和光的作用，颜色会减弱。适宜显色时间可通过实验确定。,2023/8/19,43,(1)随着时间的增加，有色化合物的浓度增大，A增大。反应完成后，A保持不变。,(2)有色化合物性质不太稳定，随着放置时间的增加，在日光，空气的的
17、作用下，有色化合物分解，浓度下降，A降低。,2023/8/19,44,d.溶剂的影响 许多有色配合物在水中解离度较大，而在有机溶剂中解离度较小。有些配合物易溶于有机溶剂。e.干扰物质的影响及消除 干扰离子本身有颜色或与显色剂作用显色等，都将干扰测定。消除干扰的方法有：(1)加掩蔽剂(2)选择适当的显色条件 如通过控制酸度，使干扰离子不作用(3)选择适当的测量条件 如波长、参比溶液等(4)分离干扰离子,2023/8/19,45,入射光波长的选择,入射光波长应根据吸收光谱曲线选择。1)在一般情况下选择最大吸收波长作为入射光的波长，因此时k 最大，测定的灵敏度高；2)如干扰物在待测物的最大吸收波长处
18、有强烈的吸收，则选择非最大吸收波长作为入射光的波长，这时灵敏度虽有下降，但却消除了干扰。,分光光度法仪器测量误差及其消除,2023/8/19,46,曲线A为钴络合物的吸收曲线曲线B为显色剂的吸收曲线,吸光度测定条件的选择,2023/8/19,47,光度计读数范围的选择,任何光度计都有一定的测量误差，误差来源于：入射光源不稳定；吸收池玻璃厚薄不均匀；池壁不够平行、表面有水迹、油污或划痕等；光电池不灵敏、疲劳现象及检流计刻度不准等。以上因素造成测量误差的总和，表现为透光度读数误差T。T与c之间是对数关系，同样的T对不同浓度造成的c不同。在不同的吸光度范围内读数，引入的浓度测量误差是不同的，因此必须
19、选择合适的吸光度读数范围。,2023/8/19,48,为了减小测量的相对误差可采取如下措施：(1)控制溶液的浓度，如改变试样的称出量或改变稀释度等。(2)如溶液已显色，则可选择合适厚度的比色皿，使吸光度在上述范围内。,2023/8/19,49,参比溶液的选择,参比溶液用来调节仪器的零点，以消除吸收池壁及溶剂等对入射光的反射和吸收带来的影响，使测得的吸光度能真正反映被测物质的含量。选择参比溶液的原则：(1)如果仅所测物质有吸收，显色剂及其它试剂均无吸收，可用纯溶剂作参比，如蒸馏水；(2)如显色剂和其他试剂略有吸收，则应用不含被测组分的试剂溶液（空白溶液）作参比溶液；,2023/8/19,50,(
20、3)如果试样中其他组分有吸收，但不与显色剂作用，当显色剂无吸收时，可用试样溶液（不加显色剂）作参比；当显色剂也略有吸收，或干扰离子也与显色剂作用且产物有吸收，可在试液中加掩蔽剂，掩蔽待测组分，再加显色剂，以此溶液作参比。,2023/8/19,51,溶液浓度的测定,工作曲线法 配制一系列不同浓度的被测组分的标准溶液，在选定的max和最佳操作条件下，测得吸光度，作工作曲线（A c），为一直线，也叫标准曲线。在完全相同条件下，测得试样溶液的吸光度，从工作曲线上查得相应浓度。,2023/8/19,52,6、影响比色分析的因素,溶剂的种类和性质；络合物的电离度；所用的试剂浓度；反应系统中氢离子浓度；试样
21、放置时间；试样及环境的温度；反应系统中离子的干扰；仪器及实验过程中的操作误差。,2023/8/19,53,一、比色分析,比色法：以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法，比色法为一种定量分析的方法。,第二节 应用实例,二、分光光度分析,2023/8/19,54,1 啤酒色度的测定啤酒色度是指啤酒颜色的深浅，是啤酒常规化验项目之一啤酒色度的高低，主要取决于制麦工艺，但与糖化、发酵等其他工艺也有关。,2023/8/19,55,啤酒色度的测定方法是以碘液做标准，取100毫升水，向其中滴加0.1N碘液，滴定至于啤酒颜色一致，所消耗碘液毫升数，即为啤酒
22、色度。,方法一、,2023/8/19,56,操作步骤,试剂,0.1N的碘液、超纯水,2023/8/19,57,实验结果,色度（0.1N碘液毫升数/100毫升）=消耗碘液毫升数X（碘液实际当量浓度/0.1）,2023/8/19,58,方法二,1原理 将除气后的啤酒注入 EBC 比色计的比色皿中，与标准 EBC 色盘比较，目视读数或自动数字显示出啤酒的色度，以 EBC 色度单位表示。,EBC欧洲啤酒协会，简称“欧啤协。”Europe Beer consortium,2023/8/19,59,2仪器 EBC 比色计(或使用同等分析效果的仪器)：具有 2.O27.0 EBC 单位的目视色度盘或自动数据
23、处理与显示装置。,2023/8/19,60,一般淡色啤酒的色度在 5.014.0 EBC 范围内；浓色啤酒的色度在 15.040.0 EBC 范围内。测定浓色或黑色啤酒时，需要将啤酒稀释至合适的色度范围(即2.027.0 EBC 范围内)，然后将实验结果乘以稀释倍数。,2023/8/19,61,2 白酒中甲醇含量的检测甲醇对人体的毒性较大，4-10g即可引起严重中毒，尤其是甲醇的氧化物甲酸和甲醛。急性中毒，头痛、恶心、视力模糊等，呼吸中枢麻痹，昏迷甚至死亡。慢性中毒表现为粘膜刺激症状，昏睡、头痛、消化障碍、视力模糊、耳鸣等，以致双目失明。,2023/8/19,62,甲醇的检测原理,酒中甲醇在磷
24、酸溶液中被高锰酸钾氧化为甲醛，过量的高锰酸钾及在反应中产生二氧化锰用硫酸草酸溶液除去，甲醇与品红亚硫酸作用生成蓝紫色醌型色素，与标准系列比较定量。,2023/8/19,63,仪器与试剂,1高锰酸钾磷酸溶液：称取3g高锰酸钾。加入15mL85%磷酸与70mL水的混合液中，溶解后加水至100mL，贮于棕色瓶内，防止氧化力下降，保存时间不宜过长。2草酸硫酸溶液：称取5g无水草酸或7g含2分子结晶水草酸，溶于1：1硫酸中至100mL。,2023/8/19,64,3品红亚硫酸溶液：称取0.1g碱性品红研细后分次加入共60mL80C的水，边加水边研磨使其溶解。用滴管吸取上层溶液过滤于100mL容量瓶中，冷
25、却后加10mL10%亚硫酸钠溶液、1mL盐酸，再加水至刻度，充分混匀，放置过夜，如溶液有颜色，可加少量活性炭减半后过滤，贮于棕色瓶中，置暗处保存，溶液呈红色时应弃去重新配制。4甲醇标准溶液：称取1.000g甲醇，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于10mg甲醇。置低温保存。,2023/8/19,65,6无甲醇的乙醇溶液：取0.3mL按操作方法检查不应显色。如显色需进行处理。处理方法：取300mL95%乙醇，加高锰酸钾少许，蒸馏，收集馏出液。在馏出液中加入硝酸银溶液（取1g硝酸银溶于少量水中）和氢氧化钠溶液（取1.5g氢氧化钠溶于少量水中）摇匀，取上清液蒸馏，弃去最初的50
26、mL馏出液，收集中间馏出液约200mL，用酒精比重计测其浓度，然后加水配成60%无甲醇的乙醇溶液。710%亚硫酸钠溶液。,2023/8/19,66,操作步骤,1.根据样品中乙醇浓度适当取样（乙醇浓度30%取1.0mL，40%取0.8mL，50%取0.6mL，60%取0.5mL），置于25mL具塞比色管中。2.吸取0.0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL甲醇标注使用液（相当0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg甲醇），分别置于10mL具塞比色管中，并加入0.5mL60%的无甲醇的乙醇溶液。,2023/8/19,67,3.于样品管及标准管中各加水至5mL，再依次各加2m
27、L高锰酸钾磷酸溶液，混匀，放置10min，各加2mL草酸硫酸溶液，混匀使之褪色，再各加5mL品红亚硫酸溶液，混匀，于20C以上静置0.5h，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长590nm处测吸光度，绘制标准曲线比较，或与标准色列目测比较。,2023/8/19,68,实验数据,2023/8/19,69,计算及结果,2023/8/19,70,式中：X1样品中甲醇的含量，g/100mL；A1_测定样品中甲醇的含量，mg；V1样品体积，mL。,2023/8/19,71,3 白酒中杂醇油含量的检测物理性质：无色至黄色油状液体。有特殊臭味和毒性。相对密度0.8110.832(20/20)。主要含有异戊醇
28、、丁醇、丙醇和庚醇等。,2023/8/19,72,有害物质杂醇油,杂醇油是酒的芳香成分之一。但含量过高，对人们有毒害作用，它的中毒和麻醉作用比乙醇强，能使神经系统充血，使人头痛，其毒性随分子量增大而加剧。杂醇油在体内的氧化速度比乙醇慢，在机体内停留时间较长。杂醇油的主要成分是异戊醇、戊醇、异丁醇、丙醇等，其中以异丁醇、异戊醇的毒性较大。原料中蛋白质含量多时，酒中杂醇油的含量也高。杂醇油的沸点一般高于乙醇(乙醇沸点为78，丙醇为97，异戊醇为13l)。在白酒蒸馏时，应掌握温度，进行掐头去尾，减少成品酒的杂醇油含量。,2023/8/19,73,检测原理,杂醇油的主要成分是异戊醇、戊醇、异丁醇、丙醇
29、等，其中的异戊醇和异丁醇在硫酸作用下分别生成戊烯和丁烯，再与对二甲氨基苯甲醛作用生成在520nm出有吸收峰的橙色物质。其吸光度与异戊醇和异丁醇的含量成正比关系，通过与标准比较可实现定量分析。,2023/8/19,74,仪器与试剂,1.0.5%对二甲氨基苯甲醛-硫酸溶液-称取 0.5g 对二甲氨基苯甲醛,加浓硫酸溶解至 l00m1,贮于棕色瓶中,如有色应重新配制。2.无杂醇油的乙醇-取 0.1ml 分析纯无水乙醇,进行显色检查,不得显色,如显色取分析纯无水乙醇 200m1,加 0.25g 盐酸间苯二胺,加热回流 2 小时,蒸馏,收集中间馏出液 l00ml。再取 0.lml 馏出液按本操作方法测定
30、不显色即可使用。,2023/8/19,75,3.杂醇油(异戊醇、异丁醇)标准溶液-准确称取 0.080g 异戊醇和 0.020g 异丁醇加入预先装有 50ml 无杂醇油乙醇的 l00ml 容量瓶中,再加水至刻度；此溶液每毫升相当于 1mg 杂醇油,置低温保存。4.杂醇油(异戊醇、异丁醇)标准应用液-吸取杂醇油标准溶液5.0ml 于 50ml 容量瓶中,加水稀释至刻度。此应用液即为每毫升相当于杂醇油 0.10mg 的标准溶液。,2023/8/19,76,操作步骤,1.将蒸馏酒稀释 10 倍后再准确吸取 0.30ml 置于 10ml 比色管中。2.准确吸取 0、0.10、0.20、0.30、0.4
31、0、0.50ml 杂醇油标准应用液(相当于 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg 杂醇油)于 10ml 比色管中。3.于样品管和标准管中准确加水至 1m1,摇匀。4.各管放入冰浴中,沿管壁各加入 2ml 0.5%对二甲氨基苯甲醛-硫酸溶液,使其流至管底,再将各管同时摇匀。5.各管同时放入沸水浴中加热 15min，取出,立即放入冰水中冷却,并立即各加入2ml水,混匀,放置 l0min。6.以零管调零点，于 520nm 波长下测各管吸光度，与标准曲线比较进行定量。,2023/8/19,77,2023/8/19,78,结果计算,式中：X样品中杂醇油的含量，g/l00ml；m测定样
32、品管相当于标准管的毫克数，mg；V样品稀释后的取样体积，ml。,国标中规定白酒中杂醇油（以异丁醇及异戊醇计）0.2 g/100mL。,2023/8/19,79,注意事项,1、在加入显色剂时，要在冰水浴中进行，并要沿管壁缓慢加入。2、在放入沸水中加热时，要将比色管的盖子打开。3、使用分光光度计时，要注意开盖调“0”，盒盖调“100”。并在使用前先进行预热。4、对二甲氨基苯甲醛-硫酸显色剂应现用现配，放置时间最多不能超过2小时，该显色剂应沿管壁缓慢加入，否则会因温度升得太快而影响显色。,2023/8/19,80,4 蛋白酶含量的检测 酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反
33、应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟生成1g 酪氨酸所需的酶量。,2023/8/19,81,实验原理,选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。,2023/8/19,82,实验仪器和试剂,仪器:恒温水浴锅、分光光度计等。枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L，
34、pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。试剂1.0.2mol/L 盐酸溶液 2.0.04mol/L 氢氧化钠溶液3.0.55mol/L 碳酸钠溶液 4.10%三氯乙酸溶液5.标准酪氨酸溶液(50g/mL)：称取12.5mg 以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2mol/L 盐酸约30mL 溶解后，蒸馏水定容至250mL。6.酪蛋白溶液(0.5%)：称取1.25g 酪蛋白，用0.04mol/L 氢氧化钠溶液(20mL)溶解，再用0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液定容到250mL。,2023/8/19,83,
35、7.0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4.12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。取A 液84mL，B 液16mL 混合后，得到0.2mol/LpH7.5磷酸缓冲液，可长期存放。临用时稀释10倍即可。8.Folin-酚试剂：在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4.2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4.2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50m
36、L 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。,2023/8/19,84,实验流程,酪蛋白,调pH值、温度，加入蛋白酶，反应一定时间,酪氨酸,比色测定,磷钼蓝磷钨蓝,加入Folin-酚试剂显色,680nm比色,计算酶活力,操作步骤,2023/8/19,85,(一)酪氨酸标准曲线的制作 取6支试管(标号0、1-5)，按顺序分别加入0.00、0.20、0.40、0.60、0.80和1.00mL 标
37、准酪氨酸溶液，再用水补足到1.00mL，摇匀后各加入0.55mol/L 碳酸钠5.0mL，摇匀。依次加入Folin酚试剂1.00mL，摇匀于30水浴锅中保温15min。然后于680nm 处测定吸光值(以0号管作对照)。以酪氨酸含量(g)作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。,2023/8/19,86,(二)酶活力测定1.酶反应：取一支试管，加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，于30水浴中预热5分钟，再加入1.0mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液，立即计时，水浴中准确保温10min，从水浴中取出后，立即加入2.0mL的10%三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟，干滤纸过滤，收集滤液(样品液)。另取一试管，先
38、加入1.0mL 已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和2.0mL 的10%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数分钟，再加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，然后于30水浴保温10min，同样干滤纸过滤，收集滤液(对照液)。,2023/8/19,87,2.滤液中酪氨酸含量的测定 取3支试管，分别加入1.0mL 水、样品液、对照液，然后各加入5.0 mL 0.55mol/L 碳酸钠溶液和1.00mLFolin-酚试剂，摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。根据吸光度值，由标准曲线查出样品液、对照液中酪氨酸含量差值，推算出酶的活力单位。,2023/8/19,88,结果处理,1.酶活单位定义：在上述条件下，酪蛋白水解1m
39、in产生1g酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。2.计算其中：A 样品样品液的吸光度值A 对照对照液的吸光度值K标准曲线上A=1时对应的酪氨酸g 数V酶促反应液的体积(本实验为5mL)T酶促反应时间(本实验为10min)N酶溶液稀释倍数,2023/8/19,89,实验原理,还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。,单糖,游离的醛基或酮基,半缩醛羟基,多糖,？,无还原性,还原性,部分寡糖,5 淀粉中还原糖含量的检测,2023/8/19,90,对没有还原性的寡糖和多糖，可以利用酸水解法将其降解成具有还原性的单糖进行测定，以求出样品中总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计算）。,2023/8/19,91,在NaOH
40、存在的条件下，3,5二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈棕红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。,黄色,棕红色,2023/8/19,92,试剂和器材,试剂标准葡萄糖溶液3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂6molL HCl6molL NaOH,材料山芋淀粉,器材容量瓶，试管，移液管，量筒，水浴锅，胶头滴管，离心机，分光光度计等。,2023/8/19,93,实验步骤,1.葡萄糖标准曲线的制作,取干净试管6支，按表1进行操作。以吸光值为纵坐标，各葡萄糖标准液浓度
41、为横坐标作图得标准曲线。,2023/8/19,94,图1 葡萄糖标准曲线,经分析得标准曲线回归方程为：y=0.2524x+0.0020，相关系数R2=0.9984。,2023/8/19,95,2.样品中还原糖的提取与测定,准确称取 3.000g山芋淀粉，加蒸馏水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml的蒸馏水冲洗研钵2-3次，洗出液转入三角烧瓶中。于50 恒温水浴中保温0.5h，不时搅拌，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到100ml离心管中，于4000rmin下离心5min，沉淀用20ml蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清液合并，用蒸馏水定容至100ml，混匀，作为还
42、原糖待测液。取1ml进行还原糖含量测定。,A1,C1,2023/8/19,96,3.样品中总糖的提取与测定,准确称取3.000g山芋淀粉，加蒸馏水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约12ml的蒸馏水冲洗研钵2-3次，洗出液转入三角烧瓶中。再向烧瓶中加入6mol/L HCl 10ml，搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5h，取出12滴置于白瓷板上，加1滴I2-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解完毕，冷却至室温后以6mol/L NaOH溶液中和至溶液呈中性，并用蒸馏水定容至100ml，过滤，取滤液10ml于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，即为稀释100
43、0倍的总糖水解液。取1ml总糖水解液，测定其还原糖含量。,A2,C2,2023/8/19,97,计算,还原糖含量（mgg）=（c1100）m,总糖含量（mgg）=（c21000）0.9m,式中：C-还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml；V-还原糖或总糖提取液的总体积，ml；m-样品重量，g；0.9-乘以0.9是为了从测定的总糖水解成单糖量中扣除水解时所消耗的水量。,2023/8/19,98,6 紫外吸收法测定核酸含量,实验原理,核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外
44、吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。,2023/8/19,99,蛋白质由于含有芳香氨基酸，也能吸收紫外光。蛋白质的吸收峰在280nm与260nm处的光密度仅为核酸的1/10或更低，因此核酸样品只能够蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。,紫外吸收法测定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达3g/ml的检测水平。,2023/8/19,100,核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以()来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数。,RNA 溶液（p
45、H=7.0）的()=7700-7800，RNA 的含磷量为9.5%，含1g/mL RNA 溶液的光密度为。,2023/8/19,101,不同形式DNA紫外光密度不同，因为DNA具有双螺旋结构，当过量的酸、碱或加热使DNA变性时，则出现（P）260nm值升高的增色效应。在核苷酸量相同的情况下，（P）260nm有以下关系：单核苷酸单链DNA双链DNA。,2023/8/19,102,DNA变性后，双螺旋结构被破坏，碱基充分暴露，导致紫外光密度增加，还可根据DNA溶液在260nm处光密度的变化监测DNA变性情况。变性DNA复性后，(P)260nm值降低，称为减色效应。,2023/8/19,103,采用
46、紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在260nm 波长下，浓度为1g/mL 的DNA 溶液其光密度为0.020;而浓度为1g/mL 的RNA 溶液其光密度为0.024。,因此，测定未知浓度的DNA(RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。,2023/8/19,104,试剂与器材,试剂：钼酸铵过氯酸沉淀剂：取3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵2.5%过氯酸溶液。5-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍。,材料 酵母RNA干粉。,2023/8/19,105,操作步骤,1.准确称取待测核酸样品0.5g，加少量0.01m
47、ol/L NaOH调成糊状,再加适量水，用5-6%氨水调至pH7.0，定容至50mL。2.取两支离心管，甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水，乙管加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在冰浴上放置30min。3.在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5 mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。,注：测定A280的值。求出A260/A280，以判断RNA的纯度。RNA=A260/A280=2.0,2023/8/19,106,结果计算,计算公式 A260 RNA浓度=x N 0.024 x L 式中，A260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值；L 比色杯的厚度，1cm；N 为稀释倍数；0.024每毫升溶液内含1gRNA的A值；1mL待测样品液中核酸（微克）核酸 1mL待测样品液中制品的毫克数 在本实验中，1mL待测液中制品量为50g。,2023/8/19,107,思 考 题,1、比色分析的原理是什么？2、简述比色分析与分光光度分析的主要区别？3、影响比色及分光光度分析的主要因素有哪些？4、比色及分光光度分析主要可应用在那些方面？试举例说明。,
