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1、1,第 七 章比色分析及分光光度法Colorimetry and Spectrophotometry,分析化学,2,基本内容和重点要求,掌握物质对光的选择性吸收、吸光度和透光度、朗伯比尔定律及摩尔吸光系数等知识了解比色分析和分光光度法的特点、基本原理、仪器构造和各部件的作用学习掌握显色反应和显色条件的选择理解掌握 分光光度法定量分析中的各种影响因素,3,本章内容提要,7.1 概述7.2 物质对光的选择性吸收7.3 光吸收基本定律7.4 比色分析和分光光度法及其仪器,4,7.1 概述,方法依据及分类方法特点,5,一、方法依据及分类,基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法、可见及
2、紫外光度法及红外光谱法等。比色分析法：通过目视比较颜色的深浅来测定物质的浓度。分光光度法：使用分光光度计测定的方法。,6,二、分光光度法的特点,灵敏度高、选择性好准确度较高应用广泛仪器简单、操作简便、分析快速,7,7.2 物质对光的选择性吸收,光的基本性质物质对光的选择性吸收,8,一、光的基本性质,光的波动性和微粒性：,9,2.电磁波谱图,10,3.单色光与复合光,单色光：具有同一波长的光复合光：不同波长组成的光可见光的波长大约在400760nm之间，由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成，各种光具有一定的波长范围。,11,4.互补光,12,二、物质对光的选择性吸收,13,1
3、.物质颜色和吸收颜色的关系,14,2.吸收光谱图,最大吸收波长max,15,3.分析依据,定性分析：最大吸收波长max定量分析：吸光度大小,16,7.3 光吸收基本定律,透光率与吸光度朗伯比尔定律吸光系数、摩尔吸光系数吸光度的加合性标准曲线（校正曲线）,17,一、透光率与吸光度,透光率或透射比,吸光度,Transmittance and absorptivity,18,透光率T与吸光度A的关系,19,二、朗伯比尔定律,Lambert-Beers Law,A吸光度K比例常数，与吸光物质的性质、入射光波长、温度等有关b液层厚度，cmc溶液的浓度，molL-1或g L-1,20,三、吸光系数、摩尔吸
4、光系数,吸光系数a：摩尔吸光系数：关系：e M a,21,例 1,50mL比色管中，加入含有0.025mg的Fe2+溶液，加入邻二氮菲显色剂，用水稀释至50mL，用2cm比色池，在分光光度计上测得吸光度A=0.190，计算摩尔吸光系数？解：,22,四、吸光度的加合性,多组分体系中,23,Standard curve，calibrated curve，working curve,五、标准曲线（校正曲线）,24,7.4 比色分析和分光光度法及其仪器,目视比色法分光光度法,25,一、目视比色法（colorimetry）,方法依据方法特点,方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。,26,二、分光光度法,
5、Spectrophotometry,27,分光光度计,基本部件,28,光源：在可见光和近红外光区，常用钨灯或碘钨灯作光源，它们辐射3202500nm波长的光；在近紫外区，常使用氢灯或氘灯，它们能辐射180375nm波长的光。,29,单色器：棱镜用光学玻璃或石英制成。光栅光通过光栅发生衍射和干涉现象而分光。,30,棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,单色器,31,光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。,原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.,32,吸收池：由无色透明的光学玻璃或石英制成。检测器：硒光电池、光电管或光电倍增管。显
6、示系统：检流计、记录仪、数字显示器、电脑等,33,检测器,硒光电池,Ag、Au,34,光电管,红敏管 625-1000 nm蓝敏管 200-625 nm,35,光电倍增管,待扫描,160-700 nm,1个光电子可产生106107个电子,36,双光束和双波长分光光度计 工作原理,37,7.2 光度分析法的设计,显色反应显色条件的选择测量波长和吸光度范围的选择参比溶液的选择标准曲线的制作,38,一、显色反应,Color reaction待测物质本身有较深的颜色，直接测定；待测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂（
7、color reagent）。按显色反应的类型来分，主要有氧化还原反应和络合反应两大类，而络合反应是最主要的。,39,显色反应的选择 选择性好，干扰少，或干扰容易消除；灵敏度高，有色物质的应大于104。有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式。有色化合物的化学性质稳定，至少保证在测量过程中溶液的吸光度基本恒定。这就要求有色化合物不容易受外界环境条件的影响。有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大，即显色剂对光的吸收与络合物的吸收有明显区别，要求两者的吸收峰波长之差（称为对比度）大于60 nm。,40,显色剂无机显色剂不多，因为生成的络合物不稳定，灵敏度和选择性也不高。如用KSCN显色测铁、钼、钨和铌
8、；用钼酸铵显色测硅、磷和钒等。有机显色剂分子中含有生色团和助色团。生色团（chromophoric group）：某些含不饱和键的基团，如偶氮基、对醌基和羰基等。这些基团中的电子被激发时需能量较小，可吸收波长200nm以上的可见光而显色。助色团（auxochromic group）：含孤对电子的基团，如氨基、羟基和卤代基等。这些基团与生色团上的不饱和键作用，使颜色加深。,41,有机显色剂多元络合物三元混配络合物离子缔合物金属离子络合剂表面活性剂体系杂多酸,42,有机显色剂磺基水杨酸：OO型螯合剂，可与很多高价金属离子生成稳定的螯合物，主要用于测Fe3+。丁二酮肟：NN型螯合剂，用于测定Ni2+
9、。1,10-邻二氮菲：NN型螯合剂，测微量Fe2+。二苯硫腙：含S显色剂，萃取光度测定Cu2+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+等。偶氮胂(铀试剂)：偶氮类螯合剂，强酸性溶液中测Th()、Zr()、U()等；在弱酸性溶液中测稀土金属离子。铬天青S：三苯甲烷类显色剂，测定Al3+。结晶紫：三苯甲烷类碱性染料，测定Tl3+。,43,多元络合物多元络合物是由三种或三种以上的组分所形成的络合物。目前应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所组成的三元络合物。三元络合物在吸光光度分析中应用较普遍。三元混配络合物：金属离子与一种络合剂形成未饱和络合物，然后与另一种络合剂结合，形成三元混合配位络合物，简
10、称三元混配络合物。例如，V(V)，H2O2和吡啶偶氮间苯二酚(PAR)形成1:1:1的有色络合物，可用于钒的测定，其灵敏度高，选择性好。,44,2.离子缔合物：金属离子先与络合剂生成络阴离子或络阳离子，再与带反电荷的离子生成离子缔合物。主要用于萃取光度法。如：Ag+与1,10-邻二氮菲形成阳离子，再与溴邻苯三酚红的阴离子形成深蓝色的离子缔合物。用F-、H2O2、EDTA作掩蔽剂，可测定微量Ag+。作为离子缔合物的阳离子，有碱性染料、1,10-邻二氮菲及其衍生物、安替比林及其衍生物、氯化四苯砷(或磷、锑)等；作为阴离子，有X-，SCN-，ClO4-，无机杂多酸和某些酸性染料等。,45,3.金属离
11、子络合剂表面活性剂体系金属离子与显色剂反应时，加入某些表面活性剂，可以形成胶束化合物，它们的吸收峰向长波方向移动（红移），而测定的灵敏度显著提高。目前，常用于这类反应的表面活性剂有溴化十六烷基吡啶、氯化十四烷基二甲基苄胺、氯化十六烷基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵、溴化羟基十二烷基三甲基铵、OP乳化剂。例如，稀土元素、二甲酚橙及溴化十六烷基吡啶反应，生成三元络合物，在pH89时呈蓝紫色，用于痕量稀土元素总量的测定。,46,4.杂多酸溶液在酸性的条件下，过量的钼酸盐与磷酸盐、硅酸盐、砷酸盐等含氧的阴离子作用生成杂多酸，作为吸光光度法测定相应的磷、硅、砷等元素的基础。杂多酸法需要还原反应的酸度范围
12、较窄，必须严格控制反应条件。很多还原剂都可应用于杂多酸法中。氯化亚锡及某些有机还原剂，例1-氨基-2-萘酚-4-磺酸加亚硫酸盐和氢醌常用于磷的测定。硫酸肼在煮沸溶液中作砷钼酸盐和磷钼酸盐的还原剂。抗坏血酸也是较好的还原剂。,47,二、显色条件的选择,实验条件包括：溶液酸度、显色剂用量、试剂加入顺序、显色时间、显色温度、有机络合物的稳定性及共存离子的干扰等。溶液的酸度M+HR=MR+H+影响被测金属离子的存在状态影响显色剂的平衡浓度和颜色影响络合物的组成 可由pH与吸光度关系曲线确定pH范围。,48,2.显色剂的用量M(被测组分)+R(显色剂)=MR(有色络合物)为使显色反应进行完全，需加入过量
13、的显色剂。但显色剂不是越多越好。有些显色反应，显色剂加入太多，反而会引起副反应，对测定不利。在实际工作中根据实验结果来确定显色剂的用量。,49,3.显色反应时间有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳定状态，并在较长时间内保持不变;有些显色反应虽能迅速完成，但有色络合物的颜色很快开始褪色;有些显色反应进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后才稳定。制作吸光度-时间曲线确定适宜时间。,50,4.显色反应温度显色反应大多在室温下进行。但是，有些显色反应必需加热至一定温度完成。5.溶剂有机溶剂降低有色化合物的解离度，提高显色反应的灵敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮颜色加深。还可能提高显色反应的速率
14、，影响有色络合物的溶解度和组成等。,51,6.干扰及其消除方法试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定。例如干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测量条件下也有吸收，造成正干扰。干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，便显色反应不完全，也会造成干扰。干扰物质在测量条件下从溶液中析出，便溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。,52,为消除以上原因引起干扰，可采取方法：控制溶液酸度加入掩蔽剂：选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作用，掩蔽剂以及它与干扰物质形成的络合物的颜色应不干扰待测离子的测定。利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态。利用校正系数用参比溶液消除显色剂和共存有色离子的干扰。选择适当的波长当溶液中
15、存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增加显色剂的用量来消除干扰。分离：以上方法均不奏效时，采用预分离方法。,53,三、测量波长和吸光度范围的选择,测量波长的选择“最大吸收原则”（maximum absorption）不仅灵敏度高，且能减少或消除由非单色光引起的对朗伯-比尔定律的偏离。“吸收最大、干扰最小”在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰测定,54,选择测定波长l2？还是l3？选择原则：灵敏度高，测量准确，干扰少。,55,吸光度范围的选择从仪器测量误差的角度来看，为使测量结果得到较高的准确度，一般应控制标准溶液和被测试液的吸光度在0.20.8范围内。可通过控制溶液的浓度（如改变试样的取样量或改
16、变显色体系的体积）或选择不同厚度的吸收池来达到目的。,56,四、参比溶液的选择,参比溶液作用：调节仪器的零点，消除由吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，扣除干扰的影响。即将参比溶液装入光学性质相同，厚度相同的比色皿，调节仪器使透过参比皿的吸光度A参为零（T%100）,57,四、参比溶液的选择,参比溶液选择：蒸馏水：试液及显色剂均无色。不加显色剂的被测试液：显色剂为无色，被测试液中存在其他有色离子。不加试样溶液的试剂空白：显色剂有颜色。一份试液加适当掩蔽剂掩蔽被测组分，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入：显色剂和试液均有颜色。改变加入试剂顺序，使被测组分不显色
17、。,58,7.3 光度分析法的误差,误差来源：偏离朗伯比尔定律非单色光引起的偏离非平行入射光引起的偏离介质不均匀引起的偏离由于溶液本身的化学反应引起的偏离 测量吸光度引入的误差吸光度A在0.20.8之间，测量的相对误差较小。,59,一、偏离朗伯比尔定律,非单色光引起的偏离目前各种分光光度计得到的入射光实际上都是具有某一波段的复合光，物质对不同波长光的吸收程度的不同，因而导致对朗伯比尔定律的偏离。克服非单色光引起的偏离的措施：使用比较好的单色器人射光波长选择在被测物质的最大吸收处测定时应选择适当的浓度范围,60,介质不均匀引起的偏离溶液不均匀时，入射光通过溶液后，有一部分因散射现象而损失，使透射
18、比减少，实测吸光度增加，使标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲（正偏离）。在光度法中应避免溶液产生胶体或混浊。,61,由于溶液本身的化学反应引起的偏离溶液中的吸光物质常因解离、络合、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗伯比尔定律。由于溶液中各吸光物质质点间的相互作用,62,二、吸光度测量引起的误差,仪器测量不准确，如光源不稳定、实验条件偶然变动、读数不准确等。对于同一仪器，读数的波动对透射比为一定值；而对吸光度读数波动不为定值。,63,当A=0.434(或透射比T=36.8%)时，测量的相对误差最小。待测溶液的透射比T在15%65%之间，或使吸光度A在0.20.8之间，
19、才能保证测量的相对误差较小。,64,7.4 应用,铁的测定：,pH=5显色，max508nm，1.1104Lmol-1cm-1,65,硅钼蓝法测定微量SiO2,pH0.52显色，提高温度可加快硅钼黄形成，max810nm，通常在620660nm测定。PO43-、AsO43-有干扰（F-）,66,钛的测定（H2O2法）,H2SO4介质显色，max410nm，720Lmol-1cm-1,干扰：Fe3+H3PO4V、W、Mo、U有干扰，但一般样品中不存在。,67,弱酸和弱碱解离常数的测定,68,本章小结,概述物质对光的选择性吸收光吸收基本定律比色分析和分光光度法及其仪器,69,示差吸光光度法Diff
20、erential Spectrophotometry原理：吸光度差与这两种溶液的浓度差成正比。以把空白溶液作为参比的稀溶液的标准曲线作为A和c的标准曲线，根据测得的A求出相应的c值，从cx=c0+c可求出待测试液的浓度，这就是示差吸光光度法定量的基本原理。,70,示差吸光光度法的误差c(即cx-c0)，测量误差为x%，结果为cx(cx-c0)x%；普通光度法的结果为cxcxx%。因cx只是稍大于c0，故cx总是远大于c，故示差吸光光度法的准确度高。参比溶液的浓度越接近待测试液的浓度，测量误差越小，最小误差可小于0.3。标尺扩展：,71,双波长吸光光度法（dual-wavelength Spec
21、trophotometry）使两束不同波长的单色光以一定的时间间隔交替地照射同一吸收池，测量并记录两者吸光度的差值。这样就可以从分析波长的信号中扣除来自参比波长的信号，消除各种干扰，得待测组分的含量。分析方法的灵敏度、选择性及测量的精密度高。被广泛用于环境试样及生物试样的分析。A与吸光物质浓度成正比。这是定量的理论依据。只用一个吸收池，以试液本身对某一波长的光的吸光度为参比，消除了因试液与参比液及两个吸收池之间的差异引起的测量误差，提高测量的准确度。,72,73,双波长吸光光度法的应用混浊试液中组分测定：一般选择待测组分的最大吸收波长为测量波长(l)，选择与其相近而两波长相差在4060 nm范
22、围内且有较大的A值的波长为参比波长。单组分的测定：进行单组分的测定，以络合物吸收峰作测量波长，参比波长的选择有：以等吸收点为参比波长;以有色络合物吸收曲线下端的某一波长作为参比波长；以显色剂的吸收峰为参比波长。两组分共存时的分别测定：当两种组分的吸收光谱有重叠时，要测定其中一个组分就必须消除另一组分的光吸收。对于相互干扰的双组分体系，它们的吸收光谱重叠，选择参比波长和测定波长的条件是:待测组分在两波长处的吸光度之差A要足够大，干扰组分在两波长处的吸光度应相等，这样用双波长法测得的吸光度差只与待测组分的浓度成线性关系，与干扰组分无关，从而消除了干扰。,74,导数分光光度法（Derivative Spectrometry）,75,络合物组成的测定饱和法(又称摩尔比法)固定一种组分(通常是金属离子M)的浓度，改变络合剂(R)的浓度，得到一系列R/M比值不同的溶液，并配制相应的试剂空白作参比液，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，R/M为横坐标作图。连续变化法(又称等摩尔系列法)cM+cR=c，改变cM和cR的相对量，配制一系列溶液，在有色络合物的最大吸收波长处测量这一系列溶液的吸光度。当溶液中络合MRn浓度最大时，cR/cM比值为n。当cM/c为0.5时，络合比为1:1；当cM/c为0.33，络合比为1:2；当cM/c=0.25时，络合比为1:3。,
