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1、第六章 现代分子诊断技术,酶联免疫吸附测定 DNA诊断系统 DNA指纹 随机扩增多态DNA遗传性疾病的分子诊断技术,传统的诊断程序先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的生理学特性；确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌，还是其他物质。实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对比较特异；诊断成本高、速度慢、效率低。如砂眼衣原体、朊病毒,现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法对病原物质进行诊断检测。一种有效的诊断方法应具备：1、专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌分子产生阳性反应；2、灵敏度(sensitivity)高；3、操作简单(simplicity).,前
2、景:2000年,DNA诊断试剂全球销售额达到6亿美元;2004年,销售额将达到20亿美元;分子诊断的其他部门销售额以每年510的速度增长;现代分子诊断试剂的生产和销售已成为现代生物技术中利润很高的一项行业.,第一节酶联免疫吸附测定,抗体高度特异地与抗原分子结合通过抗原-抗体的特异识别反应进行检测,酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA),酶联免疫吸附测定的原理,工作原理：主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合。假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在免
3、疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体。,检测过程：将待测样品结合在固相支持物（如96孔的微量滴定板）上；加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗（primary antibody）,反应后冲洗，将未结合上的一抗洗去；加入二抗（secondary antibody）。二抗通常只特异的识别一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着一种酶，如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有色物质），一抗与二抗反应完成后，再次冲洗将未与一抗结合的二抗洗去。加入无色底物。,ELISA程序和结果,使用多克隆抗体的缺点同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备的抗体的量之间
4、也会有差异。无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分，因为在ELISA检测中都会发生颜色变化。单克隆抗体特异性强 只结合抗原上某一单一位置,酶联免疫吸附测定的局限性仅凭ELISA结果容易造成误诊，ELISA检测只能作为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进行western检测。要提高ELISA检测的准确度,就必须提高一抗的特异性。在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位点的基因要表达，而且目标位点不能够以任何方式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结合。,第二节 DNA诊断系统,DNA诊断的理论基础：任何一个决定生物学特性的DN
5、A序列都应该是独特的，都可以作为专一性的诊断标记。,一、核酸杂交,工作原理：两条DNA链之间可以通过碱基配对而形成氢键。3个关键要素：探针DNA 目的DNA 信号检测,步骤：将单链目的DNA结合于膜上；加入单链、标记过的探针DNA，在一定温度和离子浓度下使探针分子与目标DNA分子碱基配对；冲洗，洗去多余的未结合的标记探针DNA；检测探针和目标DNA形成的杂合分子。,杂交探针,必须是高度特异性的DNA片段种级探针：区分两个或多个物种亚种级探针：区分物种内特定的株系DNARNA化学合成或克隆的完整基因基因的一个片段,分离杂交探针的方法：提取某一病原微生物株系的染色体DNA；限制性内切酶进行酶解；得
6、到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库；文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA进行杂交、筛选。,核酸杂交的灵敏度和可靠性极高；用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化DNA；若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的序列扩增，再进行杂交检测。从理论上讲，用DNA杂交来诊断疾病可用于对所有的致病微生物的检测。,非同位素标记探针,32P的缺点：半衰期短，仅13天；操作起来比较危险；必须要有特殊的实验室设备进行操作；放射性垃圾的处理繁琐。,非放射性杂交检测系统：通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学发光
7、物质而达到放大信号的目的。采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入DNA的方法制备探针。生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年。检测发光和颜色变化可在几小时内完成。,B,B,生物素,加入链霉素抗生物蛋白,加入生物素标记的碱性磷酸酶,探针,目的DNA,加入不同的生色或化学发光底物,荧光标记的引物直接进行PCR检测,DNA,引物1,引物2,荧光染料,PCR,层析,荧光检测,游离引物,分子夹心探针检测,发出荧光,分子夹心探针(没有荧光),荧光团,猝灭剂,目的DNA,与目的DNA杂交,疟疾的分子诊断：,检测是否存在疟原虫抽取血样进行镜检 免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体 无法区分是以前感
8、染还是现在感染DNA杂交诊断,DNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNA序列。具体的分离过程：构建一个疟原虫的核基因文库;用标记的疟原虫核DNA作探针去筛选核基因文库;选出那些杂交信号最强的克隆;用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作为DNA探针的可靠性。,锥虫的检测,锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞。显微镜检新鲜血液取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫,30-40天后杀死昆虫,镜检昆虫的肠道免疫检测:假阳性高,PCR检测针对锥虫特有的一段188bp的DNA序列设计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到1
9、88bp的条带。,细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术,抗生素的不合理使用DNA杂交PCR检测噬菌体介导,DNA杂交,设计16SrRNA为探针16SrRNA在细菌中拷贝数极高，高度的保守性特异性不是很好必须结合PCR技术,PCR检测,nested PCR针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引物 每对引物都能特异的扩增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加,PCR技术也会产生假阳性新扩增的目的DNA特异性不强;退火温度过低;模板中杂质的污染。假阴性存在Taq酶的抑制剂；模板量过少；模板DNA纯度不够。,原位PCR(in situ PCR,ISPCR)在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进
10、行扩增，并通过原位杂交进行检测。不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细胞中定位。,噬菌体介导细菌检测,将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用转基因噬菌体去侵染待测样品。噬菌体侵染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在内的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加入荧光素和ATP，就会有荧光产生。结核菌的检测抗药性菌株的检测,荧光素酶,荧光素ATP,荧光,利用宿主细胞转录、翻译,噬菌体基因,荧光素酶基因,宿主细菌,噬菌体介导的细菌检测,第三节 DNA指纹,DNA指纹是指对待测样品中的DNA进行分析所得到的具有特征性的DNA分子杂交图谱。DNA 酶解 电泳 转膜 杂交最常用的DNA探针是微卫星序列。,
11、第四节 随机扩增多态DNA,优点：一套引物可用于各种不同的核DNA；无需构建核基因库，或进行Southern杂交等复杂操作；整个过程可以实现自动化。,第五节 遗传性疾病的分子诊断技术,PCR酶解鉴定PCROLA鉴定PCR-ELISA检测同一基因中多个不同位点的突变的检测,镰刀形细胞贫血症(sickle-cell anemia),典型的单基因遗传性疾病 血红蛋白的链（珠蛋白）的第六个氨基酸Glu发生突变成Val。,血红蛋白-链上 谷氨酸变成缬氨酸,PCR酶解鉴定,正常基因为CCTGAGG镰刀形贫血病患者的基因为CCTGTGG限制性内切酶CvnI的识别序列为CC TNAGG,方法:在CvnI位点的
12、两点设计两个引物;包含CvnI位点区域的DNA片段通过PCR扩增出来;扩增的DNA用CvnI酶处理，酶解产物用凝胶电泳分开，经溴化乙锭染色后就可在紫外灯下检查DNA带型。,CvuI处理,CvuI,CvuI,CvuI,256bp,201bp,181bp,88bp,CvuI,CvuI,256bp,382bp,88bp,正常情况,镰刀形细胞贫血症,PCR 扩增,引物1,引物2,PCR产物（长726bp）,PCR/OLA鉴定,OLA(oligo-nucleotide ligation assay),寡聚核苷酸连接分析。假定一个正常的基因在一个特定的位置发生了突变，比如说150位的T突变为G。根据150
13、位两边的序列，人工合成两段短的核苷酸链，使这两段寡聚核苷酸链与基因的一条链互补。,探针X：寡聚核苷酸链的3端最后一个核苷酸正好与正常基因的150位的的核苷酸配对，探针Y：另一段寡聚核苷酸链的5端第一个核苷酸与151位的核苷酸配对。,正常基因,150,151,150,151,B,D,双链目的DNA或PCR产物,热变性,单链目的DNA或PCR产物,加探针退火,完全配对,模板有突变,不完全配对,连接酶,连接酶,加入链霉抗生物素蛋白,加入链霉抗生物素蛋白,加入碱性磷酸酶加入无色底物,加入碱性磷酸酶加入无色底物,AP,变色,无色底物,有色底物,保持无色,无色底物,PCR/OLA分析程序示意图,PCR-E
14、LISA检测,在PCR反应体系中加入生物素标记的dUTP和其他3种dNTP3端经DIG标记特异性探针包被有抗生物素抗体的酶标板抗碱性磷酸酶（AP）DIG抗体如果加入的DIG标记的探针可与扩增片段结合，则酶标板上有颜色反应发生，否则不会有颜色的变化。,同一基因中多个不同位点的突变的检测,扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）人工引入酶切位点（artificial introduction of restriction site,AIRS）直接测序法（direct sequencing,DS）多聚酶链式反应单链构象多态分析（SSCP）,扩增阻滞突变系统,等位基因特异性扩增原理 Taq缺乏3 5外切酶活性，如果引物的3 端不能与模板DNA严格互补配对，模板DNA 就不能有效的扩增。,5 TACATTAGGTT 3,野生型序列,突变序列,野生型引物,突变引物,ARMS原理示意图,野生型DNA,ARMS检测突变体举例,纯合突变体DNA,发绿光,A,T,G 3,引物3,无法扩增没有荧光,B,ARMS检测突变体举例,杂合突变体DNA,G,发黄光,C,ARMS检测突变体举例,T,C,引物1,引物2,G,T,
