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1、现代组织化学技术(Modern Histochemical Technology)华中科技大学同济医学院 解剖学系组织胚胎学教研室 李宏莲,1、经典组织化学 2、免疫组织化学 3、原位杂交组织化学,现代组织化学的内容,组 织 化 学(也称细胞化学)（Histochemistry or cytochemistry）,一、组织化学的基本概念,（一）组织化学的提出（二）组织化学的定义 在保持组织或细胞基本上不改变其生活状 态时的微细结构的条件下，采用显微镜技术观 察某些化学成分或酶活性在组织或细胞内的定 性、定位和定量及其变化规律 定性，定位，定量;组织原位，显微镜,铅法（ATP酶）,HE染色,醛复
2、红染色,HE染色,一、组织化学的基本概念,（四）组织化学技术的用途,1.某些离子:钙离子、铁离子、磷酸根离子等,2.糖类:过碘酸希父反应（PAS反应）可以显示多糖和糖蛋白的糖链,（四）组织化学技术的用途,3.脂类:甲醛固定，冰冻切片，用油红O、尼罗蓝或苏丹类脂溶性染料染色，可呈现相应颜色,4.核酸:DNA显示：福尔根反应稀盐酸水解DNA，再用希夫试剂处理，形成紫红色产物DNA和RNA同时显示：甲基绿-派若宁儿茶酚胺、蛋白质、氨基酸等等,5.酶类:通过显示酶的活性来检测酶的存在。,常用光镜酶组织化学显示法反应原理,酶组织化学基本反应原理 酶特异性底物+相关捕获剂 反应产物沉淀（有色）反应产物沉淀
3、（无色）+置换剂,酶,（孵育液内）,（组织细胞内）,镜下观察,有色沉淀,R-PO4Na2+H2O R-OH+CaHPO4CaHPO4 Co3(PO4)2Co3(PO4)2 CoS（显色）,1、金属-金属盐显示法 方法：钙-钴法,CaCl2,酶作用,Co(NO3)2,(NH4)2S,（无色沉淀）,1、金属-金属盐显示法 方法：铅法,2、偶联偶氮色素法,I、同时偶联法：该法是孵育液中的底物被酶分解后所产生的反应物沉淀立即与重氮盐形成重氮化合物的偶氮色素而显色。II、后偶联法：该法是为了防止重氮盐对酶的抑制作用，而先使酶作用于底物，使其分解产生反应物沉淀，然后将其浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色素
4、而显色。,-磷酸萘酚,-萘基氯化重氮盐,不溶性偶氮色素,酶作用,+,3、色素形成法,I、四唑盐法 是指在孵育液中含有四唑盐或双四唑盐的酶作用底物，在脱氢酶的作用下，酶作用底物分离出氢原子，形成红色或蓝色的色素，即甲月朁（cn）或二甲月朁，它们沉着在酶作用部位，即酶的定位。,四唑盐(无色),甲月朁（红色）,3、色素形成法,II、靛酚蓝法：,H3C CH3,N,N,H3C CH3,N,NH2,OH,+,酶作用,+2H2O,二甲基对苯二胺,-萘酚,靛酚,几种酶的反应原理 酸性磷酸酶 碱性磷酸酶 三磷酸腺苷酶 乙酰胆碱酯酶 细胞色素氧化酶 一氧化氮合酶,碱性磷酸酶（ALP）1、反应原理（钙-钴法）,R
5、-O-PO3Na2 R-OH+H3PO4(-甘油磷酸钠)H3PO4+CaCl2 CaHPO4 CaHPO4+Co(NO3)2 Co3(PO4)2 Co3(PO4)2+(NH4)2S CoS(棕黑色),2、孵育液的成分：3%-甘油磷酸钠 10 ml 2%巴比妥钠 10 ml 2%CaCl2 20 ml 5%MgSO4 1 ml 双蒸水 5 ml,ALP,pH 9.4,酸性磷酸酶(ACP)1、反应原理（铅法）：,R-O-PO3Na2 R-OH+H3PO4(-甘油磷酸钠)H3PO4+Pb2+Pb3(PO4)2 Pb3(PO4)2+(NH4)2S PbS(棕黑色),2、孵育液的成分：0.05 mol/
6、L 醋酸盐缓冲液（pH 5.0）10 ml 3%-甘油磷酸钠 1 ml 蔗糖 0.8 mg 硝酸铅 10 mg,ACP,pH 5.0,三磷酸腺苷酶(ATPase),1、反应原理（铅法）：APP P+H2O APP+H3PO4+能量(ATP钠盐)H3PO4+Pb2+Pb3(PO4)2 Pb3(PO4)2+(NH4)2S PbS(棕黑色),2、孵育液的成分：ATP二钠盐 10 mg 0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.2）10 ml 0.1 mol/L MgSO4 2.5 ml 2%Pb(NO3)2 1.5 ml 蔗糖 0.8 mg 双蒸水 5 ml,ATPase,Mg2+,乙酰
7、胆碱酯酶(AChE),1、反应原理（亚铁氰化铜法）：碘化乙酰硫代胆碱+H2O 硫代胆碱+醋酸 硫代胆碱+铁氰化物 亚铁氰化物 亚铁氰化物+Cu2+亚铁氰化铜(棕褐色）,2、孵育液的成分：碘化乙酰硫代胆碱 盐 5 mg 0.1 mol/L 醋酸缓冲液（pH 5.5）6.5 ml 0.03 mol/L(7.5%)CuSO4 1.0 ml 0.1 mol/L(2.94%)枸橼酸钠 0.5 ml 0.005 mol/L(0.164%)铁氰化钾 1.0 ml 双蒸水 1.0 ml,AChE,pH 5.5,细胞色素氧化酶(CCO),1、反应原理（靛酚法）：二甲基对苯二胺 二甲基对苯二胺的侧链氨基氧化 侧链
8、氨基氧化的二甲基对苯二胺+-萘酚 靛酚(蓝色）,2、孵育液的成分：-萘酚 纯酒精 二甲基对苯二胺 双蒸水 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.2 7.9）,CCO,pH 5.5,O2,线粒体标志酶,L-精氨酸,NADPH（介导）,一氧化氮合酶（NOS）,NOS,L-瓜氨酸+NO+电子,电子,NADPH（传递）,硝基四唑蓝（N-BT）,甲月替(formazan),1、反应原理（NADPH-d法）：,2、孵育液的成分：NADPH（还原辅酶）10 mg N-BT 5 mgTriton X100 0.03 mlTris-HCl缓冲液（pH 8.0）9.97ml,二、组织化学标本的制备(一)组织的
9、固定1、固定的目的：（1）保持组织细胞原有的形态结构（2）使组织硬化2、固定的优、缺点：优点：使组织细胞的形态结构得到保持 缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性 易受损,(一)组织的固定3、常用固定剂(1)甲醛：HCHO 40%甲醛溶液的商品名称为福尔 马林，10%福尔马林常用作固定剂 多聚甲醛:（HCHO)n，n=8100 4%多聚甲醛溶液常用，用磷酸盐缓冲液配制(2)戊二醛：C3H10(CHO)2 24%戊二醛溶液，较好的保存细胞的超微结构，但是保存酶活性效果不佳(3)乙醇：CH3CH2OH 80%乙醇溶液，较好的保存酶活性和糖原，但会使组织严重收缩和硬化，常与其它固定剂混合使用,4、固定的
10、方法,（一）方法：浸泡、推注、滴注（二）滴注步骤：1、开胸 2、暴露心脏 3、自心尖剪开左心室 4、插入灌流针至主动脉弓 5、固定灌流针 6、快速注入冲洗液（有时可免）7、先快后慢注入固定液 8、慢注毕，将动物装入含 有少量固定液的塑料袋 置4C冰箱内静置2h后取材,1、石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）脱水（梯度酒精）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）切片（石蜡切片机）粘片（载玻片）烤片（烤箱）组织化学染色程序,1、石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）脱水（梯度酒精）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）切片（切片机）粘片（载玻片）烤片（烤箱）组织化学染色程序,1、石蜡切片：组织取材和固定（甲
11、醛）脱水（酒精）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）切片（切片机）粘片（载玻片）烤片（烤箱）组织化学染色程序,1、石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）脱水（酒精）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）切片（切片机）粘片（载玻片）烤片（烤箱）组织化学染色程序,1、石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）脱水（酒精）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）切片（切片机）粘片（载玻片）烤片（烤箱）组织化学染色程序,1、石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）脱水（酒精）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）切片（切片机）粘片（载玻片）烤片（烤箱）组织化学染色程序,（二）组织切片的制备1、石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）
12、脱水（酒精）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）切片（切片机）粘片（载玻片）烤片（烤箱）组织化学染色程序,（二）组织切片的制备1、石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）脱水（酒精）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）切片（切片机）粘片（载玻片）烤片（烤箱）组织化学染色程序前的处理组织化学染色,（二）组织切片的制备组织化学染色程序前的处理:脱蜡（二甲苯）纯酒精置换二甲苯 梯度酒精入水 组织化学染色程序 常规脱水、透明、封片,(二)组织切片制备：2、恒冷箱切片 组织取材和固定或不固 定骤冻（液氮，198；干冰，78；冻结金属座，30）切片（恒冷箱）粘片（载玻片）晾片 组织化学染色程序 常规脱水、透明、封片,三、组织化学技术的基本要求(一)保持组织和细胞形态结构的良好状态(二)具备一定的特异性(三)具备一定的灵敏性(四)生成的反应产物必须是有色沉淀(五)反应产物具有稳定性(六)要有重复性。,
