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1、生物化学与分子生物学,蛋白质的生物合成（翻译）,第十七章,Protein Biosynthesis(Translation),蛋白质生物合成的概念,生物体内的蛋白质以mRNA为模板而合成。在这一过程中，mRNA上来自DNA基因编码的核苷酸序列信息转换为蛋白质中的氨基酸序列，故称为翻译（translation）。翻译是指在多种因子辅助下，由tRNA携带并转运相应氨基酸，识别mRNA上的三联体密码子，在核糖体上合成具有特定序列多肽链的过程。,第一节蛋白质生物合成体系,Protein biosynthesis system,基本原料：20种编码氨基酸模板：mRNA适配器：tRNA装配机：核蛋白体主要
2、酶和蛋白质因子：氨基酰-tRNA合成酶、转肽酶、起始因子、延长因子、释放因子等能源物质：ATP、GTP无机离子：Mg2+、K+,蛋白质生物合成体系,一、mRNA是蛋白质合成的信息模板,mRNA的基本结构,从mRNA 5-端起始密码子AUG到3-端终止密码子之间的核苷酸序列，称为开放阅读框架(open reading frame,ORF)。,原核生物的多顺反子,真核生物的单顺反子,遗传密码,在mRNA的开放阅读框架区，以每3个相邻的核苷酸为一组，代表一种氨基酸(或其他信息)，这种三联体形式的核苷酸序列称为密码子。,起始密码子(initiation codon)：AUG终止密码子(terminat
3、ion codon)：UAA、UAG、UGA,密码子（codon）,起始密码子和终止密码子：,遗传密码表,遗传密码的特点,1.方向性(directional),翻译时遗传密码的阅读方向是53，即读码从mRNA的起始密码子AUG开始，按53的方向逐一阅读，直至终止密码子。,2.连续性(non-punctuated),编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码子及密码子的各碱基之间既无间隔也无交叉。,由于密码子的连续性，在开放阅读框中发生插入或缺失1个或2个碱基的基因突变，都会引起mRNA阅读框架发生移动，称为移码（frame shift），使后续的氨基酸序列大部分被改变，其编码的蛋白质彻
4、底丧失功能，称之为移码突变。,3.简并性(degeneracy),一种氨基酸可具有2个或2个以上的密码子为其编码。这一特性称为遗传密码的简并性。除色氨酸和甲硫氨酸仅有1个密码子外，其余氨基酸有2、3、4个或多至6个三联体为其编码。为同一种氨基酸编码的各密码子称为简并性密码子，也称同义密码子。,各种氨基酸的密码子数目,4.摆动性(wobble),反密码子与密码子之间的配对有时并不严格遵守常见的碱基配对规律，这种现象称为摆动配对(wobble base pairing)。,反密码子与密码子的识别方式与摆动配对,5.通用性(universal),从简单的病毒到高等的人类，几乎使用同一套遗传密码，因此
5、，遗传密码表中的这套“通用密码”基本上适用于生物界的所有物种，具有通用性。密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。,已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。,二、氨基酰-tRNA通过其反密码子与mRNA中对应的密码子互补结合,tRNA的作用,运载氨基酸：氨基酸各由其特异的tRNA携带，一种氨基酸可有几种对应的tRNA，氨基酸结合在tRNA 3-CCA的位置，结合需要ATP供能；充当“适配器”：每种tRNA的反密码子决定了所携带的氨基酸能准确地在mRNA上对号入座。,二级结构,三级结构,反密码环,氨基酸臂,tRNA的构象,三、核糖体是肽链“装配厂”,核糖体的组成,核糖体又称核
6、蛋白体，是由rRNA和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒，是蛋白质生物合成的场所。,不同细胞核蛋白体的组成,核蛋白体的组成,核糖体在翻译中的功能部位,四、肽链生物合成需要酶类和蛋白质因子,氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyltRNA synthetase)，催化氨基酸的活化；转肽酶(peptidase)，催化核蛋白体P位上的肽酰基转移至A位氨基酰-tRNA的氨基上，使酰基与氨基结合形成肽键;并受释放因子的作用后发生变构，表现出酯酶的水解活性，使P位上的肽链与tRNA分离；转位酶(translocase)，催化核蛋白体向mRNA3-端移动一个密码子的距离，使下一个密码子定位于A位。
7、,起始因子（initiation factor，IF）延长因子（elongation factor，EF）释放因子（release factor，RF）,参与原核生物翻译的各种蛋白质因子及其生物学功能,参与真核生物翻译的各种蛋白质因子及其生物学功能,第二节氨基酸与tRNA的连接,氨基酸与特异的tRNA结合形成氨基酰-tRNA的过程称为氨基酸的活化。参与氨基酸的活化的酶：氨基酰-tRNA合成酶。,反应过程,一、氨基酰-tRNA合成酶识别特定氨基酸和tRNA,氨基酸与tRNA连接的专一性由氨基酰tRNA合成酶保证。氨基酰tRNA合成酶都具有高度专一性，既能识别特异的氨基酸，又能辨认应该结合该种氨基
8、酸的tRNA分子。,第一步反应,第二步反应,氨基酰tRNA合成酶还有校对活性（proofreading activity），能将错误结合的氨基酸水解释放，即将任何错误的氨基酰-AMP-E复合物或氨基酰-tRNA的酯键水解，再换上与密码子相对应的氨基酸，改正反应的任一步骤中出现的错配，保证氨基酸和tRNA结合反应的误差小于10-4。,特性,氨基酰-tRNA的表示方法,丙氨酰-tRNA：Ala-tRNAAla精氨酰-tRNA：Arg-tRNAArg甲硫氨酰-tRNA：Met-tRNAMet,各种氨基酸和对应的tRNA结合后形成的氨基酰-tRNA表示为：,氨基酸的三字母缩写-tRNA氨基酸的三字母缩
9、写,例如：,二、肽链合成的起始需要特殊的起始氨基酰-tRNA,tRNAiMet与甲硫氨酸结合后形成Met-tRNAiMet，可以在mRNA的起始密码子AUG处就位，参与形成翻译起始复合物。起始密码子只能辨认Met-tRNAiMet。,tRNAMet和甲硫氨酸结合后生成Met-tRNAMet，必要时进入核蛋白体，为延长中的肽链添加甲硫氨酸。,起始氨基酰-tRNA:Met-tRNAiMet,参与肽链延长的甲硫氨酰-tRNA：Met-tRNAMet,真核生物,具有起始功能的tRNAfMet与甲硫氨酸结合后，甲硫氨酸很快被甲酰化为N-甲酰甲硫氨酸(N-formyl methionine,fMet)，于
10、是形成N-甲酰甲硫氨酰-tRNA(fMet-tRNAfMet)，可以在mRNA的起始密码子AUG处就位，参与形成翻译起始复合物。起始密码子只能辨认fMet-tRNAfMet。,原核生物,起始氨基酰-tRNA:fMet-tRNAfMet,fMet-tRNAfMet的生成是一碳化合物转移和利用的过程之一，反应由转甲酰基酶催化，甲酰基从N10-甲酰四氢叶酸转移到甲硫氨酸的-氨基上。,第三节肽链的生物合成过程,The biosynthesis process of peptide chain,翻译过程包括起始（initiation）、延长（elongation）和终止（termination）三个阶段
11、。真核生物的肽链合成过程与原核生物的肽链合成过程基本相似，只是反应更复杂、涉及的蛋白质因子更多。,（一）原核生物翻译起始复合物的形成,指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核糖体结合而形成翻译起始复合物的过程。,1.核糖体大小亚基分离；2.核糖体小亚基结合于mRNA的起始密码子附近；3.fMet-tRNAfMet结合在核糖体P位；4.核糖体大亚基结合形成起始复合物。,一、翻译起始复合物的装配启动肽链合成,（a）起始复合物的装配过程；（b）rRNA识别mRNA的核糖体结合位点，保证翻译起始在起始密码子处,IF-3,IF-1,1.核糖体大小亚基分离,IF-3,IF-1,2.核糖体小亚基结合于mRN
12、A的起始密码子附近,原核生物mRNA在核糖体小亚基上的准确定位和结合涉及两种机制,在各种mRNA起始AUG上游约813核苷酸部位，存在一段由49个核苷酸组成的一致序列，富含嘌呤碱基，如-AGGAGG-，称为Shine-Dalgarno序列(S-D序列)，又称核糖体结合位点(ribosomal binding site,RBS)。一条多顺反子mRNA序列上的每个基因编码序列均拥有各自的S-D序列和起始AUG。,S-D序列,小亚基中的16S-rRNA 3-端有一富含嘧啶碱基的短序列，如-UCCUCC-，通过与S-D序列碱基互补而使mRNA与小亚基结合。,mRNA上邻近RBS下游，还有一段短核苷酸序
13、列，可被小亚基蛋白rpS-1识别并结合。通过上述RNA-RNA、RNA-蛋白质相互作用，小亚基可以准确定位mRNA上的起始AUG。,IF-3,IF-1,3.fMet-tRNAfMet结合在核糖体P位,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,4.核糖体大亚基结合形成起始复合物,IF-3,IF-1,IF-2,-GTP,GDP,Pi,起始复合物形成过程,（二）真核生物翻译起始复合物的形成,1.核糖体大小亚基分离；2.Met-tRNAiMet定位结合于小亚基P位；3.mRNA与核糖体小亚基定位结合；4.核糖体大亚基结合。,真核生物翻译起始复合物的装配,翻译起始复合物形成后，核糖体从mRNA
14、的5端向3端移动，依据密码子顺序，从N端开始向C端合成多肽链。,二、在核糖体上重复进行的三步反应延长肽链,1.进位(positioning)/注册(registration)2.成肽(peptide bond formation)3.转位(translocation),肽链延长在核糖体上连续循环式进行，又称为核糖体循环(ribosomal cycle)，包括以下三步：,每轮循环使多肽链增加一个氨基酸残基。,1.进位（entrance）,又称注册(registration)，是指一个氨基酰-tRNA按照mRNA模板的指令进入并结合到核糖体A位的过程。,2.成肽,成肽是指肽基转移酶（转肽酶）催化两
15、个氨基酸间肽键形成的反应。,3.转位,指的是核糖体沿着mRNA的移位。移位的结果是：成肽后位于P 位的tRNA所携带的氨基酸或肽在反应中交给了A位上的氨基酸，空载的tRNA从核糖体直接脱落；成肽后位于A位的带有合成中的肽链的tRNA（肽酰-tRNA）转到了P位上；A位得以空出，且准确定位在mRNA的下一个密码子，以接受一个新的对应的氨基酰tRNA进位。,转位需要延长因子参与。,真核生物肽链延长过程,肽链上每增加一个氨基酸残基，就需要经过一次进位、成肽和转位反应。如此往复，直到核糖体的A位对应到了mRNA的终止密码子上。,终止密码子不被任何氨基酰-tRNA识别，只有释放因子RF能识别终止密码子而
16、进入A位，这一识别过程需要水解GTP。,三、终止密码子和释放因子导致肽链合成停止,原核生物有3种RFRF1识别UAA或UAG，RF2识别UAA或UGA，RF3则与GTP结合并使其水解，协助RF1与RF2与核糖体结合。真核生物仅有eRF一种释放因子，所有3种终止密码子均可被eRF识别。真核生物中肽链合成完成后的水解释放过程尚未完全了解。,多聚核糖体的形成可以使蛋白质生物合成以高速度、高效率进行。,多聚核糖体(polysome),1条mRNA模板链都可附着10100个核蛋白体，这些核糖体依次结合起始密码子并沿53方向读码移动，同时进行肽链合成，这种mRNA与多个核糖体形成的聚合物称为多聚核糖体(p
17、olysome)。,多聚核糖体,电镜下的多聚核糖体,第四节肽链生物合成后的加工和靶向输送,新生多肽链不具备蛋白质的生物学活性，必须经过复杂的加工过程才能转变为具有天然构象的功能蛋白质，这一加工过程称为翻译后加工(post-translational processing)。,蛋白质合成后还需要被输送到合适的亚细胞部位才能行使各自的生物学功能。其中，有的蛋白质驻留于细胞液，有的被运输到细胞器或镶嵌入细胞膜，还有的被分泌到细胞外。蛋白质合成后在细胞内被定向输送到其发挥作用部位的过程称为蛋白质的靶向输送（protein targeting）或蛋白质分选（protein sorting）。,一、肽链折
18、叠为功能构象需要分子伴侣,蛋白质在合成时，还未折叠的肽段有许多疏水基团暴露在外，具有分子内或分子间聚集的倾向，使蛋白质不能形成正确空间构象。这种结构混乱的肽链集合体产生过多对细胞有致命的影响。实际上，细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自发完成的，其折叠过程需要其他酶或蛋白质的辅助，这些辅助性蛋白质可以指导新生肽链按特定方式正确折叠，它们被称为分子伴侣（molecular chaperone）。,分子伴侣的主要作用是：封闭待折叠肽链暴露的疏水区段；创建一个隔离的环境，可以使肽链的折叠互不干扰；促进肽链折叠和去聚集；遇到应激刺激，使已折叠的蛋白质去折叠。,细胞内分子伴侣可分为两大类 一类为核糖体结合
19、性分子伴侣，包括触发因子和新生链相关复合物；另一类为非核糖体结合性分子伴侣，包括热激蛋白、伴侣蛋白等。,1.热激蛋白(heat shock protein,HSP),热休克蛋白属于应激反应性蛋白质，高温应激可诱导该蛋白质合成。热休克蛋白可促进需要折叠的多肽折叠为有天然空间构象的蛋白质。热休克蛋白包括HSP70、HSP40和GrpE三族。,它有两个主要功能域：一个是存在于N-端的高度保守的ATP酶结构域，能结合和水解ATP；另一个是存在于C-端的肽链结合结构域。蛋白质的折叠需要这两个结构域的相互作用。,大肠杆菌的HSP70(DnaK),大肠杆菌的HSP40(Dna J)可激活Dna K中的ATP
20、酶，生成稳定的Dna J-Dna K-ADP-被折叠蛋白质复合物，以利于Dna K发挥分子伴侣作用。在ATP存在的情况下，Dna J和Dna K的相互作用能抑制蛋白质的聚集。Grp E，核苷酸交换因子，与Dna K的ATP酶结构域结合，使Dna K的构象发生改变、ADP从复合物中释放出来并由ATP代替ADP，从而控制Dna K的ATP酶活性。,在蛋白质的折叠过程中，HSP70还需2个辅助因子HSP40和Grp E。,HSP70 辅助肽链折叠,人类细胞中HSP蛋白质家族可存在于胞浆、内质网腔、线粒体、胞核等部位涉及多种细胞保护功能：如使线粒体和内质网蛋白质保持未折叠状态而转运、跨膜，再折叠成功能
21、构象；通过类似上述机制，避免或消除蛋白质变性后因疏水基团暴露而发生的不可逆聚集，以利于清除变性或错误折叠的多肽中间物等。,伴侣蛋白（chaperonin）是分子伴侣的另一家族，如大肠杆菌的Gro EL和Gro ES（真核细胞中同源物为HSP60和HSP10）等家族。其主要作用是为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。,2.伴侣蛋白Gro EL和Gro ES,当待折叠肽链进入Gro EL的桶状空腔后，Gro ES可作为“盖子”瞬时封闭Gro EL空腔出口。封闭后的桶状空腔提供了能完成该肽链折叠的微环境。,Gro EL-Gro ES复合物,除了分子伴侣协助肽链折叠以外，一些对于蛋白
22、质空间结构形成至关重要的氨基酸残基（如半胱氨酸、脯氨酸等）的正确折叠还需要酶促反应。这些可催化蛋白质功能构象形成所必需的酶称为异构酶（isomerase），也称为折叠酶（foldase）。,蛋白质二硫化物异构酶,多肽链内或肽链之间二硫键的正确形成对稳定分泌型蛋白质、膜蛋白质等的天然构象十分重要，这一过程主要在细胞内质网进行。二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶,多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体，空间构象有明显差别。肽酰-脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之
23、间的转换。肽酰-脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时，可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。,二、肽链的肽键水解生成活性蛋白质或功能肽,（一）合成后肽链的末端被水解加工,新生肽链的N端的甲硫氨酸残基，在肽链离开核糖体后，大部分即由特异的蛋白水解酶切除。,例：鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰,（二）肽链中肽键水解产生多种功能肽,三、肽链中氨基酸残基的化学修饰增加蛋白质功能多样性,四、亚基聚合形成功能性蛋白质复合物,结合蛋白质合成后都需要结合相应辅基，才能成为具有功能活性的天然蛋白质。,具有四级结构的蛋白质由两条以上的肽链通过非共价键聚合，形成寡聚体(ol
24、igomer)。,通过非共价键亚基聚合形成具有四级结构的蛋白质,辅基连接后形成完整的结合蛋白质,五、蛋白质合成后被靶向输送至细胞特定部位,蛋白质在核蛋白体上合成后，必须分选出来，定向输送到一个合适的部位才能行使各自的生物学功能。蛋白质的靶向输送与翻译后修饰过程同步进行。,所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要是N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这类序列称为信号序列(signal sequence)。信号序列是决定蛋白质靶向输送特性的最重要元件，提示指导蛋白质靶向输送的信息存在于蛋白质自身的一级结构中。,靶向输送的蛋白质N-端存在信号序列,蛋白细胞亚组分分选信号,细
25、胞内分泌型蛋白质的合成与转运同时发生。它们的N-端都有信号肽（signal peptide）结构，由数十个氨基酸残基组成。,（一）分泌型蛋白在内质网加工转运,信号肽有以下共性：,N-端含1个或几个带正电荷的碱性氨基酸残基，如赖氨酸、精氨酸；中段为疏水核心区，主要含疏水的中性氨基酸，如亮氨酸、异亮氨酸等；C-端加工区由一些极性相对较大、侧链较短的氨基酸（如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸）组成，紧接着是被信号肽酶(signal peptidase)裂解的位点。,信号序列引导蛋白质进入内质网,内质网中含有多种帮助新生肽链折叠成天然构型的蛋白质，如分子伴侣等。与分泌型蛋白质一样，需要停留在内质网中执行功能的蛋
26、白质先经粗面内质网上的附着核糖体合成并进入内质网腔，然后随囊泡输送到高尔基复合体。,（二）定位于内质网的蛋白质C-端含有滞留信号序列,（三）大部分线粒体蛋白质在细胞液合成后靶向输入线粒体,线粒体虽然含有DNA、核糖体、mRNA及tRNA等，可以进行蛋白质的生物合成，但绝大部分线粒体蛋白质是由核基因组编码、在胞液中的游离核蛋白体上合成后释放、靶向输送到线粒体中的。,真核细胞线粒体蛋白质的靶向输送,（四）质膜蛋白质由囊泡靶向转运至细胞膜,质膜蛋白质合成时在粗面内质网上的跨膜机制与分泌型蛋白质的跨膜机制相似，但是，质膜蛋白质的肽链并不完全进入内质网腔，而是锚定在内质网膜上。不同类型的跨膜蛋白质以不同
27、的形式锚定于膜上。,囊泡形成和转运。带阴影的字母为碱性氨基酸残基，带下划线的部分为疏水性氨基酸区域,（五）细胞核蛋白质由核输入因子运载经核孔入核,第五节蛋白质生物合成的干扰和抑制,Interference and Inhibition of Protein Biosynthesis,蛋白质生物合成是很多天然抗生素和某些毒素的作用靶点。抗生素等就是通过阻断真核、原核生物蛋白质翻译体系某组分功能、干扰和抑制蛋白质生物合成过程而起作用的。可针对蛋白质生物合成必需的关键组分作为研究新抗菌药物的作用靶点。同时尽量利用真核、原核生物蛋白质合成体系的任何差异，以设计、筛选仅对病原微生物特效而不损害人体的药物
28、。,一、许多抗生素通过抑制蛋白质生物合成发挥作用,抗生素(antibiotics)是一类由某些真菌、细菌等微生物产生的药物，有抑制其他微生物生长或杀死其他微生物的能力，对宿主无毒性的抗生素可用于预防和治疗人、动物和植物的感染性疾病。,影响翻译起始的抗生素影响翻译延长的抗生素,干扰进位的抗生素引起读码错误的抗生素 影响肽键形成的抗生素 影响转位的抗生素,常用抗生素抑制肽链生物合成的原理与应用,嘌呤霉素作用示意图,四环素族,二、某些毒素抑制真核生物蛋白质合成,某些毒素能在肽链延长阶段阻断蛋白质合成而呈现毒性，如白喉毒素是真核细胞蛋白质合成的抑制剂，它作为一种修饰酶，可使eEF-2发生ADP糖基化共
29、价修饰，生成eEF-2腺苷二磷酸核糖衍生物，使eEF-2失活。,1白喉毒素(diphtheria toxin),白喉毒素的作用机理：,白喉毒素,+,+,2蓖麻蛋白(ricin),蓖麻蛋白是蓖麻籽中所含的植物糖蛋白，由A、B两条多肽链组成。A链是一种蛋白酶，可作用于真核生物核蛋白体大亚基的28S rRNA，催化其中特异腺苷酸发生脱嘌呤基反应，使28S rRNA降解，使核蛋白体大亚基失活；B链对A链发挥毒性具有重要的促进作用，且B链上的半乳糖结合位点也是毒素发挥毒性作用的活性部位。,干扰素(interferon,IFN)是真核细胞被病毒感染后分泌的一类具有抗病毒作用的蛋白质，可抑制病毒的繁殖。干扰
30、素分为-（白细胞）型、-（成纤维细胞）型和-（淋巴细胞）型三大类，每类各有亚型，分别具有其特异作用。,三、干扰素经抑制蛋白质生物合成而呈现抗病毒作用,干扰素抑制病毒的作用机制有两方面：,一是干扰素在某些病毒双链RNA存在时，能诱导特异的蛋白激酶活化，该活化的蛋白激酶使eIF-2磷酸化而失活，从而抑制病毒蛋白质合成；二是干扰素能与双链RNA共同活化特殊的2-5寡聚腺苷酸（2-5A）合成酶，催化ATP聚合，生成单核苷酸间以2-5磷酸二酯键连接的2-5A，经2-5A活化核酸内切酶RNase L，后者可降解病毒mRNA，从而阻断病毒蛋白质合成。,干扰素的作用机理:,1.干扰素诱导eIF2磷酸化而失活,2.干扰素诱导病毒RNA降解,
