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1、第二章 免疫组织化学的基本理论与技术,一、免疫组织化学的基本理论1 原理：免疫组织化学(Immunohistochemistry)是利用抗原与抗体特异性结合的原理，使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。可在光镜和电镜水平观察细胞膜及细胞内某种抗原物质的存在，从而为研究生命大分子，特别是酶、蛋白质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的原位分析细胞组成物质的手段。,2 免疫组织化学全过程包括:抗原提取 抗体制备(博士德,华美,基因公司等购买)抗体标记 免疫染
2、色 观察分析等过程,二、抗原与抗体,1.抗原 Ag 定义：是指能刺激机体产生免疫应答，并与相应的免疫产物（抗体）发生特异性结合的物质。蛋白质：免疫原性最强；多糖：免疫原性次之；脂类和核酸：必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。,2.抗体 Ab 定义：是机体受到抗原刺激后，由免疫细胞合成并分泌出 一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白。存在部位：主要存在于血清内。分类：根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，即IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。根据制备方法不同分为两种 即单克隆抗体与多克隆抗体,IgG的结构,IgG分子呈“Y”型由两条L链和两条H链组成。用木瓜酶水解IgG可得到3
3、个片段：两个相同Fab段或抗原结合段和另一Fc段或可结晶段。在Fab段与Fc段之间有一个对酶敏感的区域，称铰链区。,多克隆抗体,制备原理：将纯化的抗原注射入动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。,单克隆抗体,Ag,合成抗体,效应性B 细胞(浆细胞),不能在体外生长,瑞士Kohler,英国Milstein,多发性骨髓瘤细胞,多发性骨髓瘤细胞,不能合成抗体,能在体外大量繁殖,脾,多发性骨髓瘤细胞,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,一抗,单
4、克隆抗体,多克隆抗体,缺点:价格较高，容易出现假阴性反应。,实质:是受同一种抗原刺激，由多个B淋 巴细胞克隆所产生的抗体混合物。,优点:容易制备，价格便宜,缺点:可能与多种特异性和非特异性的抗原决定簇反应，出现非特异性染色，影响结果的判定。,实质:是受同一种抗原刺激，由单个B淋 巴细胞克隆所分泌的抗体。,优点:特异性强，敏感性高，抗体产量高。,首选,三、免疫组织化学的基本技术,免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗原(或抗体)检测组织和细胞内的抗原，从而达到诊断或研究的目的。特定抗原(或抗体)的显示和定位是否准确与细胞和组织标本制各的质量好坏有着密切关系。因此，组织和细胞标本的取材和制备至
5、关重要。,1.组织标本制备（1）标本新鲜：一般在2h以内进行。（2）取材部位：取含待检抗原部位，还应取病灶与正常交界处，即抗原阳性和阴性区，必要时取远离病变区的正常组织作为对照。对于只研究正常组织抗原，取材时应尽可能避开坏死区。（3）避免挤压：剪刀、刀片的刃口要锋利。（4）取材大小：做石蜡切片的组织厚度不宜超过2mm，用作冰冻切片的以4mm为宜。（5）固定:化学固定,或于液氮中,或70冰箱中保存。,2细胞标本制备,(1)印片法应用：活检标本、手术切除的标本。方法：将新鲜标本暴露病区,用载玻片轻压病区，脱落细胞粘附于载玻片上，立即浸入固定液中5-10min，取出后自然干燥，低温保存。优点：简便省
6、时，细胞抗原保存较好。缺点：细胞分布不均、重叠,影响观察效果,(2)穿刺吸取涂片法 应用：实质器官的病变区。方法：穿刺液较少时直接涂片,力求均匀。穿刺液较多时，穿刺液滴入2毫升 Hanks液内，离心，制成细胞悬 液，吸一滴于载玻片上，轻涂，干燥后固定。优点：细胞均匀。缺点：细胞易变形。,(3)体液沉淀涂片法 1)细胞数较多，取一滴直接涂片。2)细胞数较少时，取5毫升自然沉淀液以1500rpm离心10min，弃上清，将沉淀涂片，略干后固定备用。,（4）体外培养细胞 1)贴壁生长的细胞：将盖玻片插入培养液中，让细胞自然贴壁于盖玻片上。2)悬浮生长的细胞：可用离心涂片机法制成涂片。（5）离心涂片机法
7、 制成2105-6ml细胞悬液,取50100l，加入涂片机内，1000rmin,2min，细胞即可均匀分布于载玻片上。,（二）免疫组织化学的固定方法,免疫组织化学固定的原则：最好地保存细胞和组织的形态结构和最大限度地保存抗原的免疫活性。方法：一）固定有物理固定，如血涂片可采用空 气快速干燥、冻结干燥等；二）化学固定,1浸入法：组织立即浸于固定液内,时间在212h之间。2灌注法：插管由左心室插入主动脉,先用PBS冲洗血液,再 以泵或吊瓶灌注固定液。在灌注后30min内取材,再置同一固定液内浸入固定l3h。可使固定液 到达全身各处组织。3微波固定：微波处理后,温度升高,分子运动加快,促进固定 液向
8、组织内渗透,短时间达到固定效果。将标本 放入510ml固定液内,置于炉中央,周边放一烧 杯盛400纯水以吸收炉内产生的热量,选择强档照 射1030s,照后固定液温度50。取出后,在 相同固定液内再固定26h(室温)。,（三）重要固定液,(1)醛类固定剂:为双功能交联剂,可使组织间相互交联，将抗原保存于原位。特点是对组织的穿透性强，收缩性小.是常用固定剂。1)10中性缓冲福尔马林：该固定剂易使组织硬化而致浸蜡困难，因此固定时间不宜过长。2)4多聚甲醛磷酸缓冲液：适应性较广泛，因较温和，适于组织标本的较长时期的保存。3)Bouins液：对组织固定力强且较均匀。比单独醛类固定更适和免疫组化染色，较常
9、用，通常4下固定68h。4)Zamboni液：用于光、电镜免疫细胞化学观察。,(2)非醛类固定剂：为非醛类双功能试剂，单独应用时，边缘固定效应较重，但与戊二醛或多聚甲醛混合使用时，效果明显好转。较适用于多肽类激素的组织固定。1)碳化二亚胺液:适用于含多肽激素组织的固定。2)碳二亚酰胺一戊二醛液(ECDG液)：对酶等蛋白质固定效果良好，对细胞内抗原定位，超微结构保存好，是培养细胞电镜免疫细胞化学的良好固定剂，也常用于多肽类激素固定。3)Zenkers液：因含重金属，固定时间要短，以24h为宜。染色前必须脱汞。,(3)丙酮及醇类固定剂：其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，能够较好地保存抗原的
10、免疫活性。但醇类对低分子蛋白、多肽及胞浆蛋白质的保存效果较差。与冰醋酸、氯仿、甲醛等混合使用，效果可明显改善。1)丙酮：常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定。保存抗原性较好，穿透性及脱水性较强。2)95%乙醇：用于冰冻切片及细胞涂片的后固定。效果较差,和其他试剂混合使用,染色较好。3)AAF液：较常用的固定液。(95100乙醇85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10m1)。4)Carnoy液：100乙醇醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4保存备用。,3固定剂的选择 固定剂的种类很多，至今尚无统一标准的固定剂，10中性甲醛是国际最通用的固定剂。需指出，同一固定液固定的组织，染色结果可截然不同
11、；不同的抗原和不同的组织标本往往需反复试验，必要时可做多种固定液对比，才能选出最佳的固定液。,(四)组织包埋和切片技术,固定的和未经固定的组织、细胞以及各种涂片和切片方法均可用于免疫组化，但其效果不同。光镜免疫组织化学的切片厚度一般为46m，而神经组织切片通常为20100m厚，以便显示神经纤维的走行。,1冰冻切片 冰冻切片(frozen section)是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。优点：1）能较好地保持抗原活性(尤其是表面 抗原)和酶的活性。2）冰冻切片简便快速，省去固定、包埋 和切片处理等一系列繁琐步骤。适用范围：新鲜的组织及已固定的组织均可作 冰冻切片。缺点：1）
12、不能用于回顾性研究。2）不利于常规检查和长期保存标本。3）不如石蜡切片结构清晰。,（1）冷冻、包埋 为防止冷冻中形成冰晶破坏组织结构和保持抗原，采取：1)浸入深低温预冷的（干冰容器内，-70)正已烷液内骤冷3060秒，或用OCT包埋剂浸透，使组织速冻，温度骤降，减少冰晶的形成。方法：干冰-丙酮法：液氮法：2)将固定后或未固定的组织置于20-30蔗糖溶液l3天。利用高渗吸收中水份;减少组织含水量。包埋、冷冻步骤同上。,(2)切片 技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。1)恒冷箱切片机(cryostat)常用、理想的切片机：切片机置于-30低温密闭室内，可连续切薄片切片时，低温室内
13、温度以-15-18为宜，温度过低组织易破碎。2)开放式冰冻切片机：切片时暴露空气中，切片技术难度大。在高温季节，切片更加困难，目前处于淘汰阶段。,(3)冰冻切片的保存使用 如不染色，必须室温下吹干30min以上，装入密封的标本盒内，外包塑料袋，置于-20低温冰箱，一个月内使用。染色前，从冰箱内取出切片，置室温干燥10min，再经丙酮固定510min(未固定者)，即可进入染色程序。,2.石蜡切片 石蜡切片(paraffin secfion)：指在切片前，固定的组织块需经乙醇逐级脱水，二甲苯透明，再浸蜡包埋。组织在浸蜡、包埋时，石蜡温度应低于60，各步骤时间均不宜过长(12h)，以免组织变脆。切片
14、一般厚约35m，切片于37烘烤过夜，可置4保存，脱水、透明也可在4进行。（详见组织学与胚胎学第六版）,3振动切片 振动切片是将新鲜组织(不固定不冷冻，或低浓度固定液稍稍固定)后用振动切片机切成20100m厚，漂浮免疫组化染色，检出阳性部位，后固定，常规电镜样品制备。适于免疫电镜细胞化学观察。,4 塑料包埋切片(plastic section)常用的包埋材料有两大类：甲基丙烯酸盐类和环氧树脂类。前者能较好地保存抗原，不与组织产生共聚合，染色前不必脱去包埋材料，但形态结构欠佳，切片易皱折；后者能较好地保持形态结构，但在聚合过程中易与组织作用，改变抗原结构。优点：组织块可同时用于一般光镜切片、半薄切
15、片(0.51.5m)和电镜超薄切片。缺点：所经步骤繁琐，抗原活性易丧失。应用范围：塑料包埋切片主要用于免疫电镜超薄切片前定位。,5.超薄切片 超薄切片(ultrathin section)适用于免疫电镜细胞化学，需用超薄切片机(详见有关电镜技术资料)。6载玻片及盖玻片的处理和切片的附贴(1)载玻片及盖玻片的处理 1)载玻片：清洗液(酸)浸泡12-24h，水洗，95乙醇浸泡2h后擦干或烤干。2)盖玻片：清洗液浸泡2h，或盐酸乙醇浸泡后水洗，95乙醇浸泡，擦干。,(2)切片的附贴 为防止染色过程脱片，适用免疫组化染色中的附贴剂：1)甘油明胶；2)甲醛一明胶；3）铬明矾-明胶；4）多聚赖氨酸(Pol
16、y-L-Lysine)；5）APES；6）APES和Poly-L-lysine联合应用：适于特别容易脱片的情况。,（五）免疫组织化学的染色方法及注意事项,一）免疫组织化学染色方法1.按标记物种类分为：免疫酶法；免疫金一银法；铁标记法；免疫荧光法；双重或多重免疫染色法等。,2.按标记抗体不同分为:（1）直接法：抗原+一抗（标记物标记）镜下观察 优点：简单，时间短，特异性强。缺点：灵敏度差，所需抗体量大，不经济，淘汰。,（2）间接法：经过二次抗体抗原+一抗+二抗（标记物标记）特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体鉴定多种抗原。,（3）非标记抗体桥法（桥连法、多步法）经过三次抗体特点：任何抗体均未被酶标
17、记；酶是与抗酶 抗体结合，避免因共价结合对抗体和酶活性的影响，提高敏感性，节约一抗用量。抗标记物抗体（用与一抗同种动物产生）抗标记物抗体+标记物=免疫复合物(如PAP，APAAP),抗原+一抗+二抗+三抗（PAP，APAAP）,1）单桥法抗原+一抗+二抗（桥抗体）+三抗（抗酶抗体）底物显色,2）双桥法 在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，可增大染色强度。特别提示：注意动物种属关系的一致性。（4）葡萄球菌A蛋白法（5）ABC法、SABC、Envision,2 免疫组化染色基本技术,（1）抗体稀释度 1）工作液-2）原液-预实验 3）抗体浓度选择-控制一定浓度范围（2）抗体滴片技术（3）PBS洗涤
18、 1）目的-保证离子浓度、PH、减少非特异反应 2）方法,（3）抗体孵育技术 湿盒、温度、时间,二）免疫组化染色注意事项：pH：中性及弱碱性 反应液和洗涤液：pH 7.2-7.4缓冲液配制 离子浓度：低离子浓度：0.01-0.02molL缓冲液 去污剂：0.05Tween20 0.01%EDTA 0.1-lTriton X-100 可分别加入反应液和染色前洗涤液内,抗体稀释液中蛋白质浓度：减少抗体的非特异性吸附 0.1-0.6牛血清白蛋白(BSA)5-10正常山羊血清 防腐剂：NaN3(0.0l)-抑制非特异性着色、提高灵敏性 温度和时间：湿度 洗涤：可除去前一步所加的未结合抗原或抗体，以消除
19、因非特异性染色。洗涤液中可加入去污剂 振荡,（六）对照,目的：证明和肯定阳性结果的特异性。主要是针对第一抗体对照，常用的对照方法包括：阳性对照；阴性对照；阻断试验；替代对照；空白对照；自身对照；吸收试验。,(一)阳性对照 已知抗原阳性的切片-阳性对照 待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。(二)阴性对照 不含已知抗原的标本-阴性对照 空白、替代、吸收和抑制试验都属阴性对照 待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。,准确判断阳性和阴性,排除假阳性和假阴性结果对照实验多次重复实验几种方法进行验证,（七）免疫细胞化学结果的判断,特异性染色与非特异性染色的鉴别点 特异性染色表现：常
20、分布于特定的部位,即具有结构性。在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。非特异性染色表现：无一定的分布规律,常为成片的均匀着色；细胞和周围的结缔组织均无区别的着色,或CT呈现强染；切片的边缘、刀痕、组织折叠部位易出现。非特异性和特异性染色同时存在：过强的非特异性染色背景,1阳性细胞的染色特征(1)阳性细胞染色分布为灶性和弥漫性，三种类型：胞浆：大部分抗原见于细胞浆 细胞核 细胞膜表面(2)细胞内含抗原量不同 染色强度不一(3）阳性细胞与阴性细胞相互交杂分布;(4)相同的阳性染色强度,不能用于判断阳性。如：切片边缘、刀痕、皱折区；坏死或挤压的细胞区；结缔组织等,结 束,2）双桥法 在三抗之后，将
21、二抗和三抗再重复一次，可增大染色强度。特别提示：注意动物种属关系的一致性。（4）PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶法Peroxidase anti-peroxidase method,PAP法）PAP法是桥法的改良，基本原理与桥法相同，只是酶（HRP）和抗酶抗体先制成免疫复合物（PAPcomplex），既抗原抗体抗IgG抗体PAP复合物，代替桥法中的抗酶抗体和随后与酶结合，把两个步骤合并为一步。该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。,（5）ABC法（亲和素生物素过氧化物酶复合物法，Avidin-biotin-peroxidase Complex method，ABC法）Avidi
22、n:亲和素，一种糖蛋白，其上有四个与生物素相结合的位点。Biotin：生物素维生素H，两者亲和力巨大，牢不可破。ABC法与PAP法的区别是：以ABC复合物代替PAP复合物。1）ABC复合物的制备：,2）ABC法反应原理,（6）SP或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵白 素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色 Streptavidin/peroxidase or streptavidin/alkaline phosphatase）该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵蛋白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO。它有四个亚基可与生物素结合，灵敏度特异，背景低，成本低。现在还有Plus盒。优点是：更简洁，放大倍数，等电点中性更适合组织。分子量小，穿透力。,
