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1、免疫细胞化学染色在白血病免疫分型和肿瘤细胞骨髓转移鉴定中的应用,前 言 白血病和肿瘤细胞骨髓转移的诊断主要靠骨髓细胞病理学诊断。骨髓细胞病理学诊断的方法主要有细胞形态学、细胞化学染色、免疫细胞化学染色、细胞遗传学以及分子生物学。根据文献报道，根据细胞形态对白血病进行分型的准确性是64%77%。细胞形态学和细胞化学结合可使准确性达86%2，但对于AML-M0、M7、M5a、MAL 鉴定有一定的困难。而免疫细胞化学染色在一定程度上可以解决此类问题。,骨髓转移性癌（BMT）原发于非造血组织的恶性肿瘤转移至骨髓的总称，骨髓不仅是造血组织恶性肿瘤的好发部位，同时又是其它恶性肿瘤常转移的部位。肿瘤经血行或
2、淋巴管转移到骨髓，有的能找到原发灶，而有的找不到原发灶，这就需要在骨髓内直接鉴定肿瘤细胞。转移到骨髓内的癌细胞同血液系统的恶性肿瘤细胞及转移癌细胞之间，在形态上有一定的区别，而对于分化较差的癌细胞其形态较难辨认，易同急性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤细胞以及其它的肿瘤细胞如神经母细胞瘤、肾上腺母细胞瘤等相混淆不易鉴别。转移到骨髓中的肿瘤细胞无组织结构特点，加之肿瘤细胞化学染色缺乏一定的特异性，使转移性肿瘤细胞的鉴定具有一定的困难，也需要用免疫细胞化学染色来解决。,一、免疫细胞化学染色定义,免疫细胞化学或称免疫组织化学是指用免疫学原理，通过特异的抗原、抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原
3、位抗原或抗体成份的方法。此法可以识别定位各种细胞组织成份。如蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、肿瘤的标记物等。在光学显微镜、荧光显微镜下观察其特定定位。,二、免疫细胞化学染色理论基础,（一）白血病免疫分型 各种血细胞来源于多能干细胞，经过分化发育而成为成熟的血细胞。这些血细胞在分化发育过程中，在其表面出现不同阶段的特异性分化抗原，利用各种特异性单克隆抗体和酶联免疫方法测定这些抗原，从而精确测定细胞类型及不同的分化阶段。白血病细胞具有与其对应的分化抗原,因此利用分化抗原可对白血病进行免疫学分型。,（二）肿瘤细胞鉴定 肿瘤是由正常细胞恶变所致，故细胞膜表面、细胞质内和细胞核内可能存在着与正常相比
4、在质或量上明显异常的物质，这些物质可以成为抗原，因而可以用特异性抗体通过免疫细胞化学染色检测。由于来源于不同组织的肿瘤细胞因为其所含的蛋白质和酶的不同，利用针对这些蛋白质和酶的各种特异性单克隆抗体对肿瘤细胞种类鉴别。,三实验方法种类,（一）仪器法：流式细胞仪、自动免疫染色仪（二）手工法（玻片法）1 根据二抗标记物不同：碱性磷酸酶法、辣根过氧化物酶法、荧光法、抗生物素-生物素法等。2 根据实验原理：二步法、三步法等。,四、免疫组化二步法染色原理,将一抗滴加在玻片上，如果被标记的细胞含有特异性抗原，则一抗抗体被结合，在洗涤过程中不被洗掉，再加入二抗酶聚合物与一抗结合。加入底物后，在酶的催化下细胞显
5、棕黄色。如果细胞不含特异性抗原，就不能与一抗结合，一抗就被洗掉，整个反应就不能进行，细胞不显棕黄色。,五、实验步骤,1.选择厚薄均匀的骨髓涂片56张，根据需要用免疫组化圈笔在涂片上画直径1.5cm左右的圆圈数个。然后将玻片置于95%酒精溶液中固定510分钟或4丙酮10分钟。2.取出玻片用流水冲洗，再用PBS缓冲液冲洗，滴加3%H2O250l，阻断内源性过氧化物酶，室温孵育10分钟。3.PBS冲洗，5分钟3。,4.滴加非免疫动物血清50l，室温孵育10 分钟。5.根据形态学初检选择需要标记的第一抗体滴在圆圈内并做好记号，然后将玻片置于湿盒内室温下1.5小时或4 过夜。6.PBS冲洗，5分钟3,7
6、.每个圆圈内滴加二抗与辣根过氧化物酶聚合物，置于湿盒内室温下0.5小时。8.取出玻片用PBS缓冲液洗5分钟3。在每个圆圈内滴加DAB显色液，置于湿盒内室温下5-15分钟。9.取出玻片用PBS缓冲液冲洗，再用苏木精复染3分钟，流水冲洗晾干。10.在显微镜油镜下观察所要标记的细胞。,六、实验结果,细胞膜、细胞浆或细胞核上出现棕黄色或棕黄色颗粒则为阳性，说明此细胞含有针对所标记的单克隆抗体的抗原，如果不显棕黄色或棕黄色颗粒则为阴性。,七、注意事项,1.标本应新鲜，彻底干燥后方能检测。通常放置24小时后检测,但标本采集后应在3-4天内测定完毕。若标本采集后不能及时测定，勿预先固定和冰箱内保存。2.滴加
7、单克隆一抗时，格外小心避免混淆。3.滴加二抗、显色剂时无需分开。4.整个检测过程中自固定后标本均应保持湿润，不能干燥，直至复染后方能使其干燥。,八、常用单克隆抗体及谱系特异性,（一）白血病免疫分型常用单克隆抗体T林巴细胞：CD2 CD3 CD5 CD7 CD8 CDl TCR-TCR-B林巴细胞：CD10 CD19 CD20 CD24 CD22 CD79 CyIgM 髓 系 细 胞：MPO CD13 CD14 CD15 CD64 CD65 CD68 CD118 血型糖蛋白A巨核细胞：PPO CD41 CD42 CD61 HLA-DR非系列特异性：TdT HLA-DR CD34,(二)白血病免疫
8、学积分系统（EGIL，1998）,分值 B系 T系 髓系 2 CD79 CD3 MPO CyCD22 TCR-Cy IgM TCR-1 CD19 CD2 CD117 CD20 CD5 CD13 CD10 CD8 CD33 CD10 CD65 0.5 CD14 CD24 CD7 CD15 CDla CD64,(二)根据白血病免疫学积分系统，将AL分为四型1.急性未分化型白血病（AUL）髓系和T或B系抗原积分均2。2.急性混合细胞白血病 有三种类型：双表型、双克隆型和双 系列型。髓系和 B或T淋巴系积分均2。3.伴有髓系抗原表达的ALL（My+ALL）T或B淋巴系积分2同时粒-单系抗原表达，但积分
9、2。伴有淋巴系抗原表达的AML（Ly+AML)髓系积分2同时淋巴系抗原表达，但积分2。4.单表型 表达淋巴系（T或B）者髓系积分为0，表达髓系者淋巴 系积分为0 5。,(三)急性髓细胞白血病微分化型(M0)特点及免疫 表型特点:M0为形态学不能分型;常规细胞化学 染色阴 性;无Auer小体。免疫表型：髓系分化抗原CD13、CD33、CD14、CD15、CD11b中至少有一种阳性。不表达B系特异性抗原（CD10、CD19、CD22、CD24）和T系特异性抗原（CD2、CD3、CD5）。可表达无系列特异性未成熟标志CD34、TdT、HLA-DR。,（四）鉴定骨髓转移性肿瘤细胞常用的单克隆抗体,1.
10、Cytokertin(Pan)细胞角蛋白（广谱）：广谱细胞角蛋白CK（AE1/AE3）主要标记角化上皮、复层鳞状上皮、复层上皮、增生的角化细胞和单层上皮，用于鳞癌、各种腺癌、移行细胞癌、小细胞癌等。2.Cytokeratin(High MW)细胞角蛋白（高分子量）：简称CK高分子。细胞角蛋白34E12为高分子量的细胞角蛋白，主要用于鳞癌的诊断。3.Cytokeratin(low MW)细胞角蛋白（低分量）：简称CK低分子。细胞角蛋白35H11为低分子量的细胞角蛋白，主要用于腺癌的诊断。,4.CD45（LCA）白细胞共同抗原：CD45（LCA）是造血细胞的特异性标记，主要分布在T、B细胞、单核细
11、胞、粒细胞和前体细胞表面，一般不存在于非造血组织中，是区别淋巴瘤、白血病和非造血组织肿瘤的一个良好标记物。5.Vimentin 波形蛋白：波形蛋白主要分布于间叶细胞及其起源的肿瘤组织。上皮细胞及其肿瘤一般不含此蛋白，主要用于间叶来源的恶性肿瘤等诊断。6.CD3：T细胞分化抗原，对早期T细胞有较高的特异性，对B细胞不表达，主要用于T细胞淋巴瘤。7.CD7：在绝大多数成熟与不成熟T细胞和T细胞白血病中表达。8.CD19：表达于前B细胞和成熟的B细胞膜表面，主要用于标记正常B细胞及肿瘤性B细胞。9.CD20：主要分布在B细胞、前B细胞后期和浆细胞之前的B细胞，一般不与T细胞呈交叉反应，在恶性淋巴瘤尤
12、其是T或B细胞淋巴瘤的分类上，CD20是最常用的B细胞标记。,10.神经元特异性烯醇化酶(NSE)主要分布于神经元和一些神经内分泌细胞中,用于神经内分泌肿瘤的辅助诊断。11.S-100 Protein 用于室管膜瘤、神经母细胞瘤、神经鞘瘤等的诊断与鉴别诊断。,李晓燕，女，29岁住院号：159299肺科3床2004年9月15日骨髓片,图片资料,崔单雨，女，9岁住院号：144061小儿科15床2004年4月5日骨髓片,杨飞祥，男，2岁住院号：158737小儿科13床2004年9月4日骨髓片,肾上腺母细胞瘤?,神经母细胞瘤？,神经母细胞瘤？,CD45,史夕琴，女，30岁住院号：161136血液科8床
13、2004年10月6日骨髓片,邵乐，男，6岁住院号：160462小儿科19床2004年9月21日骨髓片,韩茂芬，女，57岁住院号：165004感染科27床2004年10月6日骨髓片,CD7,攀胜甫，男，42岁住院号：166298消化科4床2004年11月27日骨髓片,杨雨甜，女，1岁3个月住院号：167108小儿科13床2004年11月29日骨髓片,病例测定结果,表1 FAB分型25例AML中，形态学和免疫组化均符合髓系白血病16例（占64%）；4例（16%）既有髓系又有T系抗原表达；5例（20%）既有髓系又有B系抗原表达，与文献3报道较一致。表1显示，髓系抗原CD13和CD33，在AML中表达
14、较高（分别为80%和76）。表1 25例AML CD抗原阳性表达情况,表2 11例ALL患者8种CD抗原表达显示，淋系抗原（CD3，CD7，CD19，CD20）在 ALL呈高表达，而髓系抗原（CD13 CD14 CD33）表达率低，其中有2例既表达淋系又表达髓系抗原。表2 11例ALL CD抗原阳性表达情况,表3 3例FAB难分型的白血病，2例髓系表达并且CD14阳性确诊为M5b，一例既有T系表 达又有髓系表达，确诊为M+ALL（急性淋巴细胞性白血病髓系表达）。表3 3例FAB不能定型的CD抗原阳性表达情况%,表4 10例肿瘤细胞BM转移，其中 5例癌细胞BM转移，4例CK低分子阳性，确诊为腺
15、癌。1例CK高分子阳性确诊为鳞癌。4例似诊为淋巴瘤BM浸润？恶性组织细胞病（恶组）待排，2例T系表达，2例B系表达，确诊为淋巴瘤BM浸润。1例形态上难以确定是癌还是瘤的，因CK低分子阳性，确诊为腺癌细胞。表4 10例肿瘤细胞BM转移CD和CK阳性表达情况,病例讨论,FAB对急性白血病分型，可将大部分白血病分型，仍有小部分很难定型，尤其是POX染色阴性M0、M5a、L2及MAL。由于白血病细胞形态多变性及形态学的主观性，加上有些化学染色由于试剂质量方法等因素也缺乏一定特异性，所以有小部分急性白血病根据形态及化学染色很难定型，特别是M0只能用免疫组化定型。表3 3例FAB难以定型白血病，其中1例形
16、态上象M5b，细胞核明显扭曲折叠，染色质细致，浆量丰富。M5bPOX染色阳性率3%，但其POX染色100%阴性，PAS染色呈细小颗粒弱阳性，非特异性脂酶染色阴性，而M5b应该是阳性。所以此例病例是M5b？还是L2？很难定型。,但其免疫组化显示CD14、CD33、CD13阳性，不表达淋系抗原。所以此病例确诊为M5b。其它两例也同此例类似。由于CD单抗直接测定细胞的分化抗原，且特异性强，所以可以弥补FAB分型的不足。表1和表2 25例AML和11例ALL免疫表型结果分析可以看出，急性白血病免疫分型与FAB形态学分型有较好的一致性。AML免疫分型与形态学分型完全符合者（单纯表达髓系抗原）占64%，A
17、LL免疫分型与形态学分型完全符合者（单纯表达淋系抗原）占81%，与文献报道4基本一致。约36%AML表达淋系抗原（Ly+M）和18%ALL表达髓系抗原(M+ALL)。这是因为正常造血干细胞存在髓系和淋系抗原在其分化过程中逐渐形成系列专一抗原表达，而白血病细胞不能遵循正常造血干细胞的发育分化规律。,因而出现抗原表达的紊乱，表现出免疫标志的异质性4。Ly+AML和ly-AML及M+ALL和M-ALL患者在对化疗的反应，预后等方面有很大差别。根据文献报道Ly+AML患者较之ly-AML患者对化疗反应差，预后不佳，但M+ALL则无此特征4，因此免疫分型可为临床制定化疗方案和判断疾病预后提供实验室依据。
18、临床上有些病人肿瘤细胞BM已经转移，但原发灶有时很难找到。那么BM转移的肿瘤细胞的鉴定则成为重要和必须。但从形态上有时只能确定是癌或是肉瘤，当形态不典型时，有时也不能区别。而用CK高分子单抗与CK低分子单抗，不仅能区分鳞癌和腺癌，同时将腺癌与肉瘤区分。CK高分子阳性是鳞癌，CK低分子阳性是腺癌，肉瘤细胞CK高分子和CK低分子都是阴性。,淋巴瘤BM浸润和早期恶组，由于细胞少，从形态和化学染色上很难鉴定，特别易将组织细胞样淋巴瘤诊断为恶组。随着免疫组化和分子生物学技术的发展及应用，对以前诊断的恶组重新进行研究，发现许多所谓的“恶组”病例瘤细胞并不是组织细胞源性，而是来源于其它细胞，如T细胞、B细胞
19、、NK细胞等。第四军医大学病理教研室对13例恶性组织细胞增生症免疫组织化学研究结果,9 例T 细胞性淋(CD45RO阳性),2例组织细胞肿瘤(CD68阳性),1例杂合表达(CD45RO和CD68 同时阳性),1例T细胞源性间变性大细胞淋巴瘤(CD45RO,EMA和CD30阳性),无一例B 细胞或NK细胞肿瘤(CD20和CD56 全部阴性).,WHO（2000）分类中，为避免混淆，未再提真正的恶性组织细胞增生症，而将组织细胞肉瘤作为单独一类列出，并提出组织细胞肉瘤的诊断标准：（1）表达2种或2种以上单核细胞/巨噬细胞起源的相关抗原，而不表达T和B细胞相关抗原；（2）无B细胞免役球蛋白和T细胞受体
20、基因重排。,应用免疫组化可将两者明显区分。恶组细胞单抗标记为CD14CD68La LeuM3 63D3淋巴瘤细胞为CD3CD7CD19CD20、CD10、CD45（RO）、CD45（RA）等。表4中4例淋巴瘤BM浸润恶组待排拟诊病人，因免疫组化的应用而得到明确诊断。所以鉴定BM中肿瘤细胞的种类及来源，应常规使用免疫组化。综上所述，应用免疫组化，可增加白血病诊断的准确性，弥补形态学分型的不足，鉴定BM中肿瘤细胞种类和来源，为临床白血病的化疗和判断预后提供实验室依据。,参考文献,1姚尔固，徐世荣，董作仁.新编白血病化疗学.第一版.天津：天津科学技术出版社，2000：12谭齐贤.临床血液学和血液检验.第三版.北京：人民卫生出版社，2003年2月3曾小菁，晏家益.采用免疫组化技术进行白血病免疫分型的研究，2000；24（5）：2842864裴敏飞，张广森.成人急性白血病免疫表型特征分析及意义.湖南医科大学学报，2000；25（3）：262264 5叶任高，陆再英.内科学.第六版.北京：人民卫生出版社，2004年5月,谢谢！,
