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1、疫苗中支原体的检测,11级生技母若雨指导教师：张丽娇,主要内容,1.支原体2.支原体的危害3.支原体的检测方法,培养法,指示细胞培养法,1.支原体,又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。结构也比较简单，多数呈球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。其大小介于细菌和病毒之间。可通过滤菌器，常给细胞培养工作及发酵和制药灭菌带来污染的麻烦。一般能以葡萄糖或精氨酸为主要碳源。,2.支原体的危害,致病支原体一般包括肺炎支原体，人型支原体，生殖器支原体。肺炎支原体引起支原体肺炎，又称原发性非典型肺炎，支原体肺炎全年均可发病，以冬季多见，可有小流行。人型支原体和生殖器支原体一般
2、引起尿道及生殖器的感染。,3.1培养法,推荐培养基及其处方,（1）支原体肉汤培养基 猪胃消化液500ml 氯化钠2.5g 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 5.0g 酵母浸粉5.0g 酚红0.02g pH值7.60.2于121灭菌15分钟。（2）精氨酸支原体肉汤培养基 猪胃消化液500ml 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 1.0g 酵母浸粉5.0g L-精氨酸2.0g 酚红0.02g 氯化钠2.5g pH值7.10.2。于121灭菌15分钟。（3）支原体半流体培养基 按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加 入琼脂2.53.0g。（4）支原体琼脂培养基 按（1）项处方配制，培养基中不
3、加酚红，加入 琼脂13.015.0g。,培养基灵敏度检测,（1）菌种肺炎支原体（ATCC 15531）、口腔支原体（ATCC 23714），由国家药品检定机构分发。（2）操作 将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经361培养至培养基变色，盲传2代后，将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-710-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-310-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3 支试管，置36 士1 培养7 14 天，观察培养基变色结果。(3)结果判定 以接种后培养基管数的2/3 以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。液体培养基的灵
4、敏度：肺炎支原体（ATCC 15531)应达到10-8，口腔支原体（ATCC 23714）应达到10-4。,培养基处理,检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基（或支原体琼脂培养基）。支原体半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10 15 分钟，冷却至56 左右，然后加人灭能新生牛血清（培养基与血清体积比为8:2)，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。,接种培养,取每支装量为10ml 的支原体半流体培养墓（已冷至36 士1）和支原体肉汤培养基各4 支，每支培养基接种供试品0.5 1.0ml，置36 士1 培养21 天。于接种后的第
5、7 天从4 支中取2 支进行次代培养，每1 支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2 支，置36 士l 培养21 天，每隔3 天观察1 次,结果判定,培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。,3.2指示细胞培养法（DNA染色法）,实验试剂制备,（1）二苯甲酰胺荧光染料浓缩液 称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加人100ml 不含酚红和碳酸氢钠的Hank s 平衡盐溶液中，室温下用磁力搅拌器搅拌3040 分钟，使完全溶解，-20 避光保存。（2）二苯甲酰
6、胺荧光染料工作液 无酚红和碳酸氢钠的Hank s 溶液100ml 中加人二苯甲酰胺荧光染料浓缩液lml，混匀。（3）固定液 醋酸:甲醉（体积比1:3）混合溶液。（4）封片液 量取0.1mol/L 枸橼酸溶液22.2ml、0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油50.0ml，混匀，调pH 值至5.5。,培养基及指示细胞处理,（1）DMEM 完全培养基。(2)DMEM 无抗生素培养基。(3)指示细胞（已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞）取培养的Vero细胞经消化后，制成每lml 含105 的细胞悬液，以每孔0.5ml 接种6 孔细胞培养板或其他容器，每孔再加无抗生素培养基3m
7、l，于36 士1、5 二氧化碳条件下培养过夜，备用。,供试品处理,（1）细胞培养物 将供试品经无抗生素培养液至少传1 代，然后取细胞已长满的且3 天未换液的细胞培养上清液待检。（2）毒种悬液 如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时，应用对支原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细胞进行检查。（3）其他供试品 检查时所选用的指示细胞应为该供试品对其生长无影响的细胞。,用指示细胞培养后固定封片,于制备好的指示细胞培养板中加入供试品（细胞培养上清液）2ml（毒种或其他供试品至少lml）,于36 士1、5%二氧化碳条件下培养35 天。指示细胞培养物至少传代1 次，末次
8、传代培养用含盖玻片的6 孔培养板培养35 天后，吸出培养孔中的培养液，加人固定液5ml，放置5 分钟，吸出固定液，再加5ml 固定液固定10 分钟，吸出固定液，使盖玻片在空气中干操，加二苯甲酰胺荧光染料（或其他DNA 染料）工作液5ml，加盖，室温放置30 分钟，吸出染液，每孔用水5ml 洗3 次，吸出水，盖玻片于空气中干燥，取洁净载玻片加封片液1 滴，分别将盖玻片面向下盖在封片液上制成封片。用荧光显微镜观察。,阴性、阳性对照处理,用无抗生素培养基2ml 替代供试品，同法操作，作为阴性对照 用已知阳性的供试品标准菌株2ml 替代供试品，同法操作，作为阳性对照。,结果判定,（1）阴性对照：仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧 光。（2）阳性对照：荧光显微镜下除细胞外，可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒。当阴性及阳性对照结果均成立时，试验有效。如供试品为阴性，则供试品判为合格；如供试品为阳性或可疑时，应进行重试；如供试品仍为阳性时，供试品判为不合格。,谢谢观赏,
