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1、2023/8/21,1,第9章 真核生物基因表达的调控Chapter 9 Expression regulation in Eukaryote,2023/8/21,2,真核生物与原核生物的调控差异,正负调控同等重要,2023/8/21,3,基因组结构,低等生物,高等真核生物,2023/8/21,4,核小体结构如图所示:,2023/8/21,5,2023/8/21,6,DNA水平,基因丢失基因扩增基因重排甲基化修饰染色质的结构状态,RNA水平,转录水平调控RNA的转录后加工mRNA转运mRNA稳定性,蛋白质水 平,翻译过程翻译后加工蛋白质的稳定性,真核生物基因表达的调控：,2023/8/21,7
2、,1、基因丢失,一、染色体水平的调控,马蛔虫（Parascaris equoorum）（2n=2）,2023/8/21,8,2023/8/21,9,非洲爪蟾的染色体上有约450拷贝编码18SrRNA和28SrRNA的DNA，在卵母细胞中它们的拷贝数扩大了1000倍.一旦卵母细胞成熟，多余的rDNA就没有用了，将被逐渐降解。,2、基因扩增（amplification）,基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，它使细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。,多线染色体（polytenne chromosomes）DNA可以特异扩增上千倍，而在异染区附近
3、只可复制几次。,2023/8/21,10,基因组序列的选择性扩增,1.dhfr 基因 氨甲喋呤（methotrexate）二氢叶酸还原酶(DHFR)均染色区（homogeneously staining region,HSR）双微体(double-minute chromosomes),2023/8/21,11,均染色区（homogeneously staining region,HSR）,2023/8/21,12,双微体(double-minute chromosomes),2023/8/21,13,2023/8/21,14,2023/8/21,15,3、基因重排（rearrangement
4、）,将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称基因重排。,通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因的表达以及酵母的接合型转变.,2023/8/21,16,免疫球蛋白的重排,抗体有100万种以上，一种淋巴细胞只产生一种抗体1.指令学说：上世纪40年代由Pauling提出2.克隆选择学说：1957年 Burnet提出3.体细胞重组学说：上世纪60年代提出，1976年由利根川进（日本）证实。,2023/8/21,17,产生抗体 B细胞 体液免疫 经法氏囊(Barsa of Fabricius)细胞分裂骨髓 经胸腺 调节免疫应答 T细胞 细胞免疫 杀伤抗原,
5、2023/8/21,18,免疫球蛋白的肽链主要由可变区（V区）、恒定区（C区）以及两者之间的连接区（J区）组成,2023/8/21,19,2023/8/21,20,2023/8/21,21,2023/8/21,22,二、染色质水平的调控,在细胞核内基因组DNA以核小体（nucleosome）为基本单位形成染色质（chromatin）。核小体在DNA上的组装是一个干扰DNA复制、基因表达和细胞周期进展的过程。,2023/8/21,23,1、染色质的状态,阻遏状态：DNA被压缩在细胞核中，基因处于非活性状态，组蛋白为染色质活性的阻遏蛋白；活性状态：具有活性潜能的基因失去H1，处于染色质的伸展状态；
6、激活状态：顺式调控元件中结合了基础转录因子及激活因子等，活性染色质处于松弛状态。,2023/8/21,24,真核基因的活跃转录是在常染色质上进行的。转录发生之前，染色质常常会在特定的区域被解旋松弛，形成自由DNA。这种变化可能包括核小体结构的消除或改变，DNA本身局部结构的变化等，这些变化可导致结构基因暴露，促进转录因子与启动区DNA的结合，诱发基因转录。,活性的染色质,2023/8/21,25,异染色质结构致密，处于阻遏状态 组成型异染色质：在各种细胞中都处于凝聚状态，如着丝粒、端粒等，不能转录，不含基因。兼性异染色质：在某种发育阶段或生理条件下由常染色质变成异染色质（异染色质化），如哺乳动
7、物X染色体常染色质结构疏松，是进行活跃转录的部位。,2、异染色质化：,2023/8/21,26,染色质的占先模型提出：如在启动子上已形成了核小体，那么转录因子和RNA聚合酶是不能和启动子结合的；如转录因子和RNA聚合酶在启动子上已建立了稳定的起始复合体，那么组蛋白将被排除在外。,3、组蛋白对基因活性的影响,2023/8/21,27,组蛋白对5S rRNA基因转录的影响,如：爪蟾有两类5SrRNA基因，一类只出现在卵母细胞中（卵母细胞型5SrRNA），另一类在卵母细胞和体细胞中都被转录（细胞型5SrRNA）。Why？纯DNA的体外转录：两者都转录；染色质的体外转录：卵母细胞中卵母细胞型5srRN
8、A基因有活性，但体细胞无,2023/8/21,28,组蛋白的乙酰化和去乙酰化,组蛋白的乙酰化和基因表达的状态相关。高乙酰化是活性染色质的标志之一，低乙酰化常伴随着转录沉默。HATs(histone acetytransferases)组蛋白乙酰化酶HDACs(histone deacetylases)HATs有两组，一组为A组，和转录有关；另一组是B组，和核小体装配有关。,2023/8/21,29,乙酰化促进基因转录 组蛋白H4的去乙酰化是雌性哺乳动物一条X染色体失活的原因之一。组蛋白乙酰化与转录起始复合体的装配 乙酰化导致组蛋白正电荷减少，削弱了它与DNA的结合能力，使核小体解聚；阻止了核小
9、体装配，使染色质处于松弛状态；组蛋白去乙酰化与基因沉默 组蛋白去乙酰化可导致基因转录受抑制,2023/8/21,30,辅激活因子可能有HAT乙酰化核小体组蛋白尾巴的活性,2023/8/21,31,用DNA酶I处理各种组织的染色质时，发现处于活性状态的基因比非活性状态的DNA更容易被DNA酶I所降解。鸡成红细胞（erythroblast）染色质中，-血红蛋白基因比卵清蛋白基因更容易被DNA酶I切割降解。鸡输卵管细胞的染色质中被DNA酶I优先降解的是卵清蛋白基因，而不是-血红蛋白基因。,活性染色质的DNAase高敏感性,2023/8/21,32,一般在转录起始点附近，即5端启动子区域，少部分位于其
10、它部位如转录单元的下游。,超敏感位点的存在是活性染色质的重要特征，与基因的表达有密切关系,超敏感位点（hypersensitive site)：含有转录活性基因周围对DNase高度敏感的区域。,2023/8/21,33,4、核基质与基因活性,染色体DNA通过长约200bp富含AT的基质附着区（matrix attachment region，MAR）结合于核基质（nuclear matrix，也称骨架蛋白）。核基质可为DNA复制提供结构支架，参与RNA的转录和加工DNA与核基质的结合具有特异性。如卵蛋白基因与小鸡卵巢细胞的核基质结合，而不与肝脏或红细胞的核基质结合。珠蛋白基因不与卵巢核基质结合
11、，而与红细胞的核基质结合,2023/8/21,34,5.DNA甲基化与转录抑制,m5C（5-甲基胞嘧啶)是真核生物 DNA中的主要修饰成分,多发生在CpG序列中,2023/8/21,35,用同裂酶（isoschizomers）可检测CCGG上C的甲基化状态。MspI可切割CmCGG或CCGG，HpaII可切割未甲基化CCGG,HpaII,2023/8/21,36,在一些不表达的基因中，启动区的甲基化程度很高，而处于活化状态的基因则甲基化程度较低。,去甲基化又可使基因恢复活性。,2023/8/21,37,2023/8/21,38,甲基化的转录抑制作用机制：DNA甲基化直接干涉特异性转录因子与各自
12、启动子内识别位点的结合。甲基化CpG结合蛋白（MeCP）与模板DNA结合，阻止转录。甲基化影响染色质的结构。稳定染色质的失活状态，阻止转录因子进入，防止染色质的活化,2023/8/21,39,DNA甲基化的生物学效应,X染色体失活亲本印迹肿瘤发生个体发育,CpG甲基化,2023/8/21,40,基因组印记(genomic imprinting),2023/8/21,41,1956年A.Prader 和H.Willi 父源染色体15q11-13区段缺失,智力低下、过度肥胖、身材矮小、小手足,Prader-Willi综合征(PWS),Angelman综合征(Angelman Syndrome，AS
13、)1968年H.Angelman 母源染色体15q11-13区段缺失。特殊容貌、大嘴、呆笑、红面颊、步态不稳、癫痫、严重智力低下,2023/8/21,42,近年研究表明，基因组印迹是两个亲本等位基因的差异性甲基化造成了一个亲本等位基因的沉默，另一个亲本等位基因保持单等位基因活性,2023/8/21,43,印记:来源于父母本的一对等位基因表达不同。如源于父本的IGF-(胰岛素样生长因子)基因可表达，而源于母本的则不能表达。此是由于卵母细胞中的IGF-已被甲基化，而精子中的IGF-未被甲基化，所以这一对等位基因在合子中表现不同。,2023/8/21,44,亲本的IGF-等位 基因在早期胚中被差异甲
14、基化，在成体形成配子时仍保留原甲基化的模式。,2023/8/21,45,目前在人类和鼠身上已辨明了20种印迹基因。,2023/8/21,46,雌性胎生哺乳类动物细胞中两条X染色体之一在发育早期随机失活，以确保其与只有一条X染色体的雄性个体内X染色体基因的剂量相同。一旦发生X染色体失活，使该细胞有丝分裂所产生的后代都保持同一条X染色体失活。,DNA甲基化与X染色体失活,失活X染色体特点,组蛋白H4不被乙酰化,CpG岛的高度甲基化,2023/8/21,47,抑癌基因甲基化 不表达,肿瘤发生,2023/8/21,48,2023/8/21,49,三、真核生物转录水平的调节,顺式作用元件（cis-act
15、ing element）包括启动子、增强子和沉默子等反式作用元件（trans-acting element）激活因子、阻遏因子等,2023/8/21,50,1、顺式作用元件（cis-acting element）,（1）启动子（promoter）,RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。,2023/8/21,51,（2）增强子（enhancer）,能使基因转录频率明显增加的DNA序列。,2023/8/21,52,增强子的作用原理,2023/8/21,53,（3）沉默子（Silencer）,某些基因含有负性调节元件沉默子，当其结合特异
16、蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。,2023/8/21,54,2、反式作用因子,三个功能结构域：DNA结合结构域；转录激活结构域；调控因子的激活结构域（蛋白质与蛋白质结合）能识别并结合顺式作用元件(cis-acting element)正调控与负调控,反式作用因子 识别/结合 顺式作用元件中的靶序列 启动转录例：转录因子TFD 识别结合 TATA box 转录因子 SP1 识别结合 GC box 转录因子 CTF1 识别结合 CCAATbox,2023/8/21,55,螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix)锌指结构(zinc finger motif)亮氨酸拉链结构(leucin
17、e zipper)螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)碱性螺旋(alkaline-helix),DNA结合域(DNA-banding domain),蛋白质因子识别和结合DNA元件所必需的结构域,2023/8/21,56,2023/8/21,57,是最简单的结构基序之一，该结构域长约20个aa，主要是两个-螺旋区和将其隔开的转角。C端螺旋被称为识别螺旋区，可与DNA大沟中的碱基直接接触。另一端螺旋无特异性,与DNA骨架接触,螺旋-转角-螺旋（Helix-turn-helix，HTH）,2023/8/21,58,锌指结构（zinc finger，ZF）,一个蛋白质结构域，长
18、约30个aa，其中4个氨基酸（4个Cys或2个Cys，2个His）与一个Zinc原子相结合，形成一个四面体结构。与Zinc结合后锌指结构较稳定。与DNA双螺旋大沟结合,半胱氨酸,2023/8/21,59,1,2,3,4,5,6,7,8,9,蛋白质,2023/8/21,60,2023/8/21,61,螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）,约由60aa组成，含有2个螺旋，由长约920个氨基酸残基的连接区(环)相连，两个螺旋富含高度保守的疏水氨基酸残基。同时具有DNA结合和形成蛋白质二聚体的功能，其DNA结合功能是由一个较短的富碱性氨基酸区所决定的。,2023/8/21,62,
19、一段肽链上每隔7个aa出现一个leu，借助于leu侧链的疏水相互作用而形成同向平行的拉链状，进而形成二聚体结构。由肽链氨基端2030个富含赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）的结构域与DNA结合。,亮氨酸拉链（leucine zipper，ZIP）,2023/8/21,63,蛋白质与蛋白质结合结构域,一般由20100aa残基组成据结构特点分为：酸性氨基酸聚集的结构域：负电荷高度集中，呈酸性；有一个两亲性螺旋，螺旋一侧富含酸性氨基酸，另一侧为疏水性残基富含谷氨酰胺的结构域：富含谷氨酰胺富含脯氨酸的结构域：,2023/8/21,64,蛋白质调节因子功能的鉴别方法,蛋白质与DNA的结合能力 方法：电泳
20、迁移后滞分析（EMSA）足迹法分析DNA上蛋白质结合位点,2023/8/21,65,电泳迁移后滞分析（EMSA）,2023/8/21,66,足迹法,2023/8/21,67,蛋白质蛋白质互作的分析,酵母双杂交试验,2023/8/21,68,2023/8/21,69,2023/8/21,70,四、基因转录后水平的调控,1、不同剪接方式可产生不同的mRNA,不同5端的选择 选择不同的3端 选择不同外显子,按不同方式对mRNA前体进行的剪接。,2023/8/21,71,5端的选择有的基因具有两个启动子区，每一区都有它自己的组织调控元件，那么两个长度不同的转录本将会产生组织特异性mRNA和蛋白产物。,
21、2023/8/21,72,选择不同的3端利用多个多聚（A）位点和不同的剪接方式产生不同的蛋白质,2023/8/21,73,选择不同外显子,2023/8/21,74,2、RNA干扰（RNA inference）,RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指当细胞中导入与内源性mRNA同源的双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。,2023/8/21,75,RNAi于2002年被美国Science杂志评选为全球年度十大科学进展之首。,2023/8/21,76,美国
22、科学家克拉格米洛(47),美国科学家安德鲁费里(45),2023/8/21,77,RNA干扰的作用机制,长片段dsRNA在细胞内被Dicer酶切成长度大约为19-23nt的小片段干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)，由siRNA参与构成复合物RISC(RNA-induced silence complex)。siRNA通过与同源mRNA的特异配对，引导RISC特异地降解同源mRNA，导致基因表达的抑制。因此小片段的siRNA也可以诱导高效的基因沉默。,2023/8/21,78,2023/8/21,79,RNAi技术,2023/8/21,80,五、翻译水平的调节
23、,1、mRNA的稳定性,原核生物mRNA的半衰期很短，平均大约3min。高等真核生物迅速生长的细胞中mRNA的半衰期平均3h。在高度分化的终端细胞中许多mRNA极其稳定，有的寿命长达数天。,2023/8/21,81,polyA尾影响mRNA的稳定性 polyA逐步消减到完全消失，常常是mRNA开始降解的先兆。polyA尾调节mRNA的翻译效率 带有polyA的mRNA比脱尾的相应mRNA翻译效率高得多，且影响程度与polyA尾的长度呈正相关。,polyA尾的调节作用,2023/8/21,82,polyA的长度与半衰期有关不同种类不同进化程度的mRNA的polyA长短不一，哺乳动物细胞polyA
24、平均长度为200-250，而低等真核细胞的polyA较短，平均为100nt。mRNA的半衰期与polyA尾的长度呈正相关。,3非翻译区链内剪切引起降解,3UTR区富含AU，其AUUUA序列负调控元件，促mRNA降解,2023/8/21,83,2、5UTR对翻译的调节,5端m7G帽子结构 保护mRNA免遭5外切酶的降解，增加mRNA的半衰期；有利于mRNA从细胞核向胞质转运。mRNA前导序列 前导序列长度在17-80nt的范围内，体内翻译效率与前导序列的长度成正比。其二级结构可抑制翻译,2023/8/21,84,Control of Gene Expression,Packaging,Transportation,2023/8/21,85,
