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1、第十五章 真核生物基因的表达调控,In multicellular eukaryotes,differential regulation of gene expression is at the heart of cellular differentiation and function.The central question is,how an organism expressed a subset of genes in one cell type and a different subset of genes in another cell type.,真核生物与原核生物的调控差异,真
2、核生物基因的表达调控系统远比原核生物复杂。,真核基因组的复杂性 与原核生物比较，真核生物的基因组更为复杂，可列举如下:,1、真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4106bp，哺乳类基因组在109bp数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。,2、真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。,细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA
3、，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。,原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体；,原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列(repetitive sequences)。用复性动力学等实验表明有三类重复序列：高度重复序列(high repetitive sequences),这类序列一般较短，长10-300bp，在哺乳类基因组中重复106次左右，占基因组
4、DNA序列总量的10-60%，人的基因组中这类序列约占20%，功能还不明了。,中度重复序列(moderate repetitive sequences)，这类序列序列多数长100-500bp，重复101-105次，占基因组10-40%。例如哺乳类中含量最多的一种称为Alu的序列，长约300bp，在哺乳类不同种属间相似，在基因组中重复3-5105次，在人的基因组中约占7%，功能也还不很清楚。在人的基因组中18S/28SrRNA基因重复280次，5SrRNA基因重复2000次，tRNA基因重复1300次，5种组蛋白的基因串连成族重复30-40次，这些基因都可归入中度重复序列范围。单拷贝序列(sin
5、gle copy sequences)。这类序列基本上不重复，占哺乳类基因组的50-80%，在人基因组中约占65%。绝大多数真核生物生物为蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因。,原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。,从上述可见：真核基因组比原核基因组复杂得多，至今人类对真核基因组的认识还很有限，现在国际上制订的人基因组研究计划(human gene project)
6、完成，绘出人全部基因的染色体定位图，测出人基因组109bp全部DNA序列后，搞清楚人全部基因的功能及其相互关系，特别是对了解基因表达调控的全部规律是有帮助的。,基因表达=基因转录+翻译基因表达的调控:生物体随时调整不同基因的表达状态,以适应环境、维持生长和发育需要。主要是转录水平的调控基因转录的调节：1.DNA序列2.调控蛋白 RNA聚合酶3.DNA-蛋白质相互作用 活性的影响,第一节 真核生物中基因表达水平的分析,一、真核生物基因表达水平分析的方法,1、主要通过RNA驱动的动力学杂交实验来分析,待测RNA复杂度 待测RNA的Rot1/2球蛋白mRNA复杂度 球蛋白RNA的Rot1/2,=,2
7、、丰余度,=,每细胞mRNA含量待测mRNA组分（%）6 1023,待测组分的复杂度（相对分子质量）,第二节 染色质水平上的基因活化调节,一、染色质的疏松及活性染色质的特征,真核生物中基因的转录是以染色体结构的一系列重要的变化为前提的。,真核生物的重要特征之一是其核基因组DNA与蛋白质结合，形成以核小体为基本单位的染色质结构而存在于细胞核内。这种结构特征产生了真核生物基因转录前在染色体水平上独特的调控机制，这也就是说基因的转录是以染色质结构的一系列重要变化为前提的。对昆虫多线染色体的研究表明，基因的活跃转录是在常染色质上进行的。转录发生之前，染色质常常会在特定的区域被解螺旋或变得很疏松。,Th
8、e exact pattern of puffs differs in different types of cells(e.g.,salivary gland vs.gut)differs with changing conditions in one type of cell.For example,giving the molting(蜕皮)hormone ecdysone（蜕皮激素）to an insect causes a predictable change in the puffing pattern.,These eight photomicrographs show the
9、changes in the puffing pattern of equivalent segments of chromosome 3 in Drosophila melanogaster over the course of some 20 hours of normal development.,如水蜡虫（Pseudococcus nipae）的异染色质化 水蜡虫（2n=10）在体细胞里来自父本的5条染色体依次被异染色质化，在精子形成时丢失，只保留来自母本的5条染色体。,另一方面，染色体中的异染色质化也是调节的重要因素,剂量补偿（dosage conpensation）雌性哺乳动物X染
10、色体的失活,1.无汗性外胚层发育不良 2.三色猫 3.G-6-PDH,性连锁无汗腺外胚层发育异常基因在3代女性中出现体细胞嵌镶现象。受累者缺乏汗腺。体表无汗腺区域用蓝色表示(引自Griffithset al1993),X-连锁的6-磷酸葡糖脱氧酶(G-6-PD)的测定也为莱昂假设提供了有力证据。女性虽然有二条X染色体，但其G-6-PD活性和男性的相同，表明其X染色体的总量有一半是失活的，这正好说明了剂量补偿作用。G-6-PD有A，B两种类型，二者之间只有一个氨基酸的差异，但电泳带的迁移率不同，A带比B带移动得快一点。它们分别由一对等位基因GdA和GdB编码。GdA或GdB纯合的女人从各种组织取
11、样进行电泳分析都只出现一条电泳带。GdA/GdB杂合的女人电泳的结果却会出A、B两条带。,用胰酶处理杂合体的皮肤细胞，使其分成单个细胞，然后进行克隆培养，每个克隆都来一个单细胞，再从各个克隆中取样进行电泳发现，每个克隆只出现一条电泳带或A，或B，而绝不出现二条带（图18-28）。表明细胞中虽有一对等位基因GdA/GdB的存在，但由于有一条X染色体失活，使其上的等位基因不能表达，所以只出现一条带。,三色猫（又叫做玳瑁猫）也是一个很好的例子。雌性的三色猫腹部的毛是白色的，背部和头部的皮毛由桔黄色和黑色斑组成。这种雌猫是一个X-连锁基因杂合体，X-连锁的b基因控制橙色毛皮，其等位基因B是控制黑色的毛
12、皮。带有b基因的X染体若失活，B基因表达，产生黑色毛斑，若带有B基因的X染色体若失活，b基因表达，则产生橙黄色毛斑。,二、DNase的敏感性和基因表达,当一个基因处于转录活性状态时，含有这个基因的染色质区域对DNase（一种内切酶）降解的敏感性要比无转录活性区域高得多。这是由于此区域染色质的DNA蛋白质结构变得松散，DNase易于接触到DNA之故。,在鸡胚红细胞的核中，珠蛋白基因对DNase的降解是敏感的，而编码卵清蛋白的基因是不表达的，它对DNase的降解是不敏感的。,在母鸡输卵管细胞的核中，卵清蛋白的基因是具有转录活性的，而珠蛋白基因是没有活性的。卵清蛋白基因的序列对DNase的降解要比珠
13、蛋白基因的序列敏感得多。,鸡的珠蛋白和卵清蛋白基因。,染色质的变化可表现在对DNase的敏感性上,用DNAaseI来鉴别基因的活性,不同组织中DNA的水解不一样,在成体的红细胞中，成体-球蛋白基因对DNAaseI的降解是高度敏感的，对胚胎-球蛋白基因是部分敏感的(可能是由于扩散效应)，但对卵清蛋白基因是不敏感的。,胚胎-球蛋白基因,成体-球蛋白基因,卵清蛋白基因,探针检验的不同结果,DNase敏感区的范围随着基因序列的不同而变化，从基因周围几个kb到两侧20kb大小不等。仔细分析具有转录活性基因周围的DNA区域，表明有一个中心区域存在，称为超敏感区域（hypersensitive region
14、）或超敏感位点（hypersensitive site），它对DNase是高敏感的。,由于对DNase的敏感性反映了染色质中DNA的活性，这些位点一般称为染色质中特殊DNA暴露区域。,一般在转录起始点附近，即5端启动子区域，少部分位于其他部位如转录单元的下游。,用DNA酶处理染色质可以得到酸溶性的DNA片段，而且处理时间越长，产生酸溶性DNA的比例越大，直到全部染色质都被降解掉。用特定基因的cDNA或mRNA作探针，可以测定某个基因被 DNA酶降解的情况。当总体 DNA的 10被降解成酸溶性物质时，50以上的活跃表达基因已优先降解了。,说明基因转录时染色体具有解螺旋状况,这种容易被DNA酶影响
15、的结构就被称为“活性染色质”。,超敏感位点是一段长200bp左右的DNA序列，这些区域是低甲基化区；并可能有局部解链的存在；不存在核小体结构或结构不同寻常，此区因DNA的裸露易和多种酶或特异的蛋白质结合，也就是说易于和反式作用因子结合。,染色质对DNase的敏感性与2种非组蛋白有关，那就是HMG14和HMG17，活化染色质中每10个核小体就结合一个HMG分子。,当从红细胞中提取出这两种蛋白时，珠蛋白基因不再对DNase出现敏感，当将这两种蛋白重新加入到此系统中，敏感性又可得到恢复。,超敏感位点建立于转录起始之前，转录的诱导物除去后，超敏感位点仍然存在，但转录却很快停止，说明超敏感位点的存在是转
16、录起始的必要条件，但不是充分条件。,HMG14 and HMG17 位于细胞核的不同位置。两种蛋白质双标记后在共聚交显微镜下的图象HMG14(red)and HMG17(green).,HMG蛋白的C端含活性氨基酸，可与核小体核心组蛋白的碱性区域相结合。HMG蛋白的N端1/3的区域氨基酸序列与H1和H5的C端十分相似。而HMG在核小体上位置与H1相近，HMG和组蛋白相互作用。可以竞争性取代H1和H5，核小体缺乏H1和H5将使染色质变得松散，成为具有转录活性的状态。,除HMG以外可能还有别的因素会影响到染色质的活性，当把上述两种HMG加到鸡脑细胞的染色质中，其中珠蛋白基因所在区域并不表现出对DN
17、ase的敏感，表明红细胞和脑细胞还存在其他因子的差异，这些因子在盐抽提后仍留在染色质中，它们决定了红细胞珠蛋白基因区域在HMG14和HMG17存在时对DNase敏感。,活性染色质部分的染色体蛋白的分析表明：组蛋白H1与活性染色质结合并不紧密；4种核内组蛋白在活性染色质中的含量正常，但乙酰化程度比非活性染色质中的同样的组蛋白高；在活性染色质中，组蛋白H2B较少磷酸化；较少变异的H2A在活性染色质中有很高程度富集，H2A在许多生物中都有发现，包括在果蝇和人类中；活性染色质中的核小体结合了两种相关的小分子量的非组蛋白HMG14和HMG17（high-mobility-group），这些HMG蛋白在全
18、部染色质中，每10个核小体结合1个，这与其只存在于活性染色质的事实是一致的，而且其氨基酸序列在进化过程中是高度保守的，表明它们有很重要的功能。,组蛋白在活性染色的形成中具有重要的作用！,三、组蛋白与非组蛋白p354,真核的染色体是由DNA与组蛋白（histone proteins）、非组蛋白(nonhistone proteins，NHP)构成的复合物。基因转录的调节最终必定涉及特殊DNA的核苷酸序列，这些序列可被相应的调节物分子所识别。,(一)组蛋白对真核基因表达的作用 从进化的意义上说组蛋白是极端保守的，在各种真核生物中它们的氨基酸顺序，结构和功能都十分相似。此外在生物体中从细胞中分离到的
19、5种不同类型的组蛋白都是以恒定的方式沿着DNA排列。,组蛋白沿着DNA均匀分布所产生的系统，不可能对成千上万个基因的表达进行特异控制。,组蛋白仍可被修饰，如甲基化，乙酰基化和磷酸化。若被组蛋白复盖的基因将要表达。那么组蛋白必须要被修饰，使其和DNA的结合由紧变松，这样DNA链才能和RNA聚合酶或调节蛋白相互作用。,组蛋白的作用本质上是真核基因调节的负控制因子，即它们是基因的抑制物。非活性的染色质要变成为活性的染色质其结构可能要发生改变，现有两种组蛋白置换模型：,组蛋白的N端伸出表面,1染色质结构改变模型-组蛋白置换,(1)占先模型(pre-emptive model)模型认为：决定的因素是转录
20、因子和组蛋白谁先占据调控位点。DNA复制时，组蛋白8聚体解离，转录因子乘机结合到调控位点上，一直持续到下一个复制周期，抑制了组蛋白和DNA的结合。例1：当5S rRNA基因与组蛋白结合时TFA不能激活此基因。而TFA可与游离的5S rRNA基因结合，再加入组蛋白不能使此基因失活。例2：含腺病毒启动子的质粒能被TFD结合，再被RNA pol 转录，如先加入组蛋白，则不起始转录，如先加入TFD则形成的染色质中，模板仍能转录,染色质的占先模型提出：如在启动子上已形成了核小体，那么转录因子和RNA聚合酶是不能和启动子结合的；如转录因子和RNA聚合酶在启动子上已建立了稳定的起始复合体，那么组蛋白将被排除
21、在外。,(2)动态模型(dynamic model)近来研究表明：组蛋白置换需输入能量。一些转录因子结合DNA时可裂解核小体，或建立一个可产生核小体定位结合位点的边界。如果蝇Hsp70启动子上的核小体在体外实行 重建。GAGA(细胞核结合蛋白)转录因子与启动子中4个富含(CT)n位点结合，破坏了核小体，形成一高敏感区，而且导致邻接的核小体重排，这样它们就优先插入到随机位点。核小体打开的过程是需要水解ATP的耗能过程。,染色质的转录模型依赖于那些通过水解ATP提供能量，从特异DNA序列取代核小体的因子,（二）组蛋白的乙酰化和去乙酰化控制染色活性,组蛋白的乙酰化和基因表达的状态相关。组蛋白H4的去
22、乙酰化是雌性哺乳动物一条X染色体失活的原因之一。HATs(histone acetytransferases)组蛋白乙酰化酶HDACs(histone deacetylases)HATs有两组，一组为A组，和转录有关；另一组是B组，和核小体装配有关。,辅激活因子可能有HAT乙酰化核小体组蛋白尾巴的活性,在酵母中SIN3和Rpd3的突变将阻遏基因转变。SIN3和Rpd3与DNA结合蛋白Ume6形成复合物，而此复合物阻遏具有由Ume6 结合的URS1(上游阻遏序列)元件的启动子转录。Rpd3具有HDACs活性。,去乙酰化和基因活性的阻遏有关,阻遏复合体含有3个成分：DNA结合亚基，辅阻遏物和组蛋白
23、的去乙酰化酶,Pc-G蛋白不起始阻遏，但可维持阻遏,（三）非组蛋白的调节功能,非组蛋白是一组高度不均一的组织特异性蛋白，与核内DNA相结合，分子量1015 kDa。据认为在控制基因表达中发挥功能。如高泳动率蛋白(high mobility group proteins，HMG)。,这类蛋白在染色质结构组成以及基因调控中发挥着重要的作用。其中两种高丰富度小分子量（30kDa）的高泳动蛋白14，高泳动蛋白17(HMG14/17)家族可聚集于活化的染色质上，这一现象表明它们可能有助于染色质高级结构的解聚。,HMG蛋白的另一个重要作用是使DNA成环，这种构象和DNA多种活性有关，如转录时在其相邻的不同
24、位点上将结合调节因子(如SRY因子和增强体)。,非组蛋白质是特定mRNA合成的重要原因,基因表达与组蛋白和非组蛋白相关,证据表明有转录活性染色质的外形要比无转录活性染色质的要松散得多。这是核小体中DNA的高度紧密的二级结构和三级结构打开了，使DNA易于接近调节蛋白和RNA聚合酶,四、转录基因与核小体的结构,真核细胞中基因转录的模板是染色质DNA，而染色质的基本结构单位是核小体。在转录时，RNA聚合酶大约和50bp的DNA结合，且其中有12个bp需发生解链；再者RNA聚合酶（相对分子质量约 5.00105）远大于一个核小体（相对分子质量约 2.62105）。,早期的观点认为只有在染色质结构被破坏
25、、核小体解体、DNA完全暴露的条件下，RNA聚合酶才能进行转录。,近年来有不少实验表明RNA聚合酶进行基因转录时并不是在完全暴露的模板DNA上进行的。如在SV40的微染色体中，正在转录的基因仍然有核小体结构。,用微球菌核酸酶处理染色质，然后进行凝胶电泳，发现转录的基因和不转录的基因都出现200bp间隔的DNA“梯”带。这也说明转录的基因和非转录的基因其核小体数目没有显著差异，只是转录基因对微球菌核酸酶更为敏感，降解也更快，因此其核小体数目略少，这很可能是RNA聚合酶所经过的部分的核小体中组蛋白被暂时移开，待RNA聚合酶离去后又立即恢复了核小体的结构。,核小体结构的动态变化的研究表明，真核细胞染
26、色质中的核小体都有两种可能的趋向：与相邻的或较远的核小体聚集；解聚为H2A-H2B二聚体和H3-H4四聚体。,两者处于动态平衡状态，而外界的因素如连接区的组蛋白、装配蛋白或转录因子等都可使平衡状态改变为另一种构象。,组蛋白H3-H4 四聚体一旦组装到核小体中就很稳定，H2A-H2B 二聚体与它的结合却极易破坏。,这种疏松结构的核小体可能正是 RNA聚合酶有效转录核小体DNA模板序列的基础。,DNA围绕核小体盘旋，核小体可以携带不同的化学修饰，或者允许或者抑制缠绕其上的DNA表达。细胞每次分裂时，双链DNA分裂为两条单链，每条单链再生成新的双链。核小体尽管不像DNA链一样复制，它们分布在两个新生
27、成的DNA双链间，空的地方由新的核小体填充。因此细胞分裂是特定DNA区域的核小体成分发生改变的机会。而且化学反应也会使不同类型核小体之间发生互换。,细胞分离后产生基因的失活及基因特性的保持。,组蛋白甲基化转移酶,核小体的相位与基因转录有着重要的联系。相位（phase positioning），指的是在同一类型的所有细胞中，组蛋白八聚体在DNA序列上特殊的定位。在染色质中由于相位的改变，使围绕在核小体核心外的DNA上涉及某个基因的启动子和增强子序列被暴露出来，这样的核小体相位就会对该基因的调控产生重要的影响。特异序列的核小体相位还可以促进远距离调控元件的联系，通过DNA盘绕使得较远的顺式作用元件
28、彼此接近，形成一种特殊的三维结构。如在有关的体外模型中类似的结构可以使爪蟾卵黄蛋白基因转录活性提高10倍。,五、DNA的甲基化和去甲基化与基因活性的关系,真核生物DNA中大约2070的胞嘧啶存在着甲基化修饰，其中尤以卫星序列的甲基程度最高。甲基化多发生在 CG二核苷酸对上，有时甚至CG二核苷酸对上的两个 C都出现基化，称为完全甲基化，即 5mCpG 33 GpCm5但也有只有一个 C是甲基化的，这种CG对则称为半甲基化。,半甲基化,使用某些型限制性内切酶有助于研究DNA序列的甲基化状况。如限制酶 Hpa 识别并切割未甲基化的 CCGG序列，对甲基化的 CG对则不起作用，而限制Msp识别并切割所
29、有的CCGG序列，不论此 CCGG是否甲基化。因此，可以用 Msp来识CCGG序列的存在与否，用 Hpa 来鉴别这些 CCGG序列是否甲基化。,在同一组织不同细胞中甲基化在DNA上的位置总是一致的。因为双链DNA中，CG在相对链上是成对出现的，这种对称性就为甲基化或未甲基化的CG形式都提供了复制基础，而甲基化又是 DNA合成后的一种修饰。当 DNA上某一个 CG对呈完全甲基化，DNA复制所产生的子链就会各有一个半甲基化的CG碱基对。这时，细胞内的维持甲基化酶可以识别半甲基化CG对，并使之完全甲基化。,去甲基化的途径，或者是由去甲基酶去除，或者是 DNA复制时由于某种原因甲基化酶未能在半甲基化处
30、催化甲基化，于是在以后的DNA复制中产生完全去甲基化的DNA分子。,在大鼠个体发育过程中,核内DNA甲基化的程度不同,14天的胚胎肝只有8%rDNA甲基化,18天的胚胎肝有30%rDNA甲基化,而成年的大鼠肝组织rDNA的甲基化程度达60%。,5-aza是胞嘧啶核甙的一 类似物，能引起DNA中某些胞嘧啶的去甲基化，从而参与激活表型特异性的基因的表达。,呜呜呜,拟南芥全基因组甲基化图谱,DNA甲基化抑制转录。实验证明，在特异性表达某些基因的组织中，活跃基因内和附近的5-mCCGG比非表达组织中明显降低 30左右；同时，哺乳动物细胞核内 80的甲基化 CG对是在有H1的紧密结构的核小体中。,可见基
31、因表达与DNA甲基化呈负相关。,DNA甲基化对转录的抑制主要取决于甲基化CG对的密度和启动子的强度这两个因素。启动子附近甲基化CG对的密度是阻遏作用的主要决定因素之一。,弱启动子可以被散在的甲基化CpG完全阻遏，如果外加增强子使启动子强化，那么，在同等程度的甲基化影响下转录可以恢复；若是甲基化CpG位点进一步增加，转录就会完全停止。,说明在转录的充分激活和完全阻遏之间的调节开关，决定于甲基化CpG的密度和启动子强度的平衡。,DNA的甲基化和去甲基化同基因活性的关系也并不是绝对的。动物种属之间5-mC水平的变化很大。一般，脊椎动物特别是哺乳动物DNA甲基化程度较高，而无脊椎动物DNA中甲基化的程
32、度就低得多。哺乳动物体细胞的基因可以以高度甲基化（如雌性的一条X染色体）的非活化状态存在，也可以在诱导下去甲基化（组织或发育阶段特异性），或自始至终保持低水平甲基化（如持家基因）而具有转录活性。,一些低等真核生物如酵母、果蝇和其他双翅目昆虫中至今未发现DNA甲基化。说明甲基化不是一种原始现象，而可能是出现于某一进化时期，并随着进化程度的提高而逐步增强。因此甲基化或去甲基化对基因表达调控的作用随生物的不同种类而异，即便同一种生物，甲基化对不同基因活性也有不同的效应。另外，有的基因如 rDNA形成了容忍一定的甲基化的能力，能够在不发生去甲基化的情况下进行转录；对于其他大多数基因，则是通过甲基化不足
33、或去甲基化的方式来调节转录。,六.亲本印记(imprinting),印记:来源于父母本的一对等位基因表达不同。如源于父本的IGF-(胰岛素样生长因子)基因可表达，而源于母本的则不能表达。此是由于卵母细胞中的IGF-已被甲基化，而精子中的IGF-未被甲基化，所以这一对等位基因在合子中表现不同。目前在人类和鼠身上已辨明了20种印迹基因。大多数人类的印迹基因集中在三个簇中。在每个基因簇上都存在着特异的印记盒(imprinting box)，能顺式调节印迹基因的亲本特异性表达，这些位点表现出亲本特异性的甲基化作用和去甲基化作用。,亲本的IGF-等位 基因在早期胚中被差异甲基化，在成体形成配子时仍保留原
34、甲基化的模式。,Recognition of imprinted inheritance of Prader-Willi and Angelman syndromes,通过小鼠的核移植，可发现不同来源基因组间存在差异。,七、基因丢失、重排、扩增与基因活性的调节,在个体发育过程中，作为RNA合成的DNA模板也会发生规律性的变化来控制基因表达和生物体的发育。这种变化往往是由于基因本身或其拷贝数发生了永久性的改变。,通过基因丢失、基因扩增和基因重排等方式在DNA水平上进行基因活性的调节。这些调控方式与转录和翻译水平的调控不同，是从根本上使一些细胞的基因组发生改变。,1、染色体丢失,马蛔虫（Paras
35、caris equoorum）（2n=2）,性细胞,马蛔虫受精卵细胞内只有一对染色体（2n=2）（另一亚种2n=4），但染色体上有多个着丝粒。,马蛔虫（Parascaris equoorum）受精卵细胞内只有一对染色体（2n=2）（另一亚种2n=4），但染色体上有多个着丝粒。在发育早期仅一个着位点发挥作用，保证正常有丝分裂的进行。发育后一阶段，在纵裂的细胞中染色体分成很多小片段，其中部分含着丝点，不含着丝点的片段在分裂中丢失。而在横裂的细胞中染色体并不丢失。第一次卵裂是横裂，产生上下两个子细胞，由于受精卵中含有的各种物质并不是匀一分布，而是从上面的动物极到下面的植物极呈一种梯度分布，它影响到分
36、裂的方向和染色体的丢失。第二次卵裂时下面的子细胞仍进行横裂，保持着原有的基因组，而上面的子细胞却进行纵裂，丢失了部分染色体。长此下去最下面的子细胞总是保持了全套的基因组，将发育成生殖细胞，其余丢失了部分染色体片段的细胞分化为体细胞。此可能是由于在植物极中有特殊的物质的存在，这种物质具有保护染色体不丢失的功能。,小麦瘿蚊（Mayetiole destructor）受精卵的细胞核分裂，而受精卵不分裂，形成合胞体（syncytium）。当核第3次分裂后，有两个核移向卵后端的一个特殊区域，叫做极质，在极质中的核保持了全套的染色体（2n=40），将来分化为生殖细胞。而在一般的细胞质中，丢失了32条染色体
37、，只保留8条，将来分化为体细胞。若在细胞核移向极质前，用细尼龙丝在极质处进行结扎，不让核移入极质或者用紫外线照射极质，结果所有的核中都只保留了8条染色体。极质中有很多核糖体样的颗粒，可以保护染色体不被削减，当紫外线照射后破坏了其功能，染色体照样也会丢失，最终不能发育为生殖细胞。,2、DNA重排,DNA重排(DNA rearrangement)是基因活性调节的另一种重要的方式。根据DNA片段在基因组中位置的变化，即从一个位置变换到另一个位置。最熟知的两个例子是酵母交配型的控制和抗体基因的重排。（以下不讲！）,（1）酵母的交配型改变中的基因重排,细胞的交配型是受MAT座位的基因控制。当细胞转化交配
38、型时，MAT座位的或a被另一种交配型DNA的拷贝替换，图中MAT座位的a被取代，使HML、MAT、HMR三个位点的基因发生重排，改变了交配型。,酿酒酵母3号染色体上含有交配型信息的三个拷贝，HML和HMRa座位分别含有两个互补基因的一个拷贝，和a，但是这两个座位的转录都受SIR基因的抑制。,1.交配型的转换（switch）,1977年Hicks,T.B.等提出了暗箱模型（cassette model）活性暗箱（active cassette）沉默暗箱（silent cassettes）沉默子（silencers）,交配型（matimg-tyne）外激素（pheromones）因子是一个13肽（
39、WHWLQLKPGQPMY）a因子是12肽（YIILGLFWAPY）（二）交配型的信号传递（signal transduction）,信息素和受体转录因子,酵母交配型转换的分子机制,作用于HO基因转录的三个系统,（2）免疫球蛋白的重排,抗体有100万种以上，一种淋巴细胞只产生一种抗体1.指令学说：上世纪40年代由Pauling提出2.克隆选择学说：1957年 Burnet提出3.体细胞重组学说：上世纪60年代提出，1976年由利根川进证实。,产生抗体 B细胞 体液免疫 经法氏囊(Barsa of Fabricius)细胞分裂骨髓 经胸腺 调节免疫应答 T细胞 细胞免疫 杀伤抗元,RAG(rec
40、ombonation active gene)等位排斥(allelic exclusion)有效重排(productive rearrangement)印迹基因(imprinted gene):等位排斥的一种型式。来源父本和母本的等位基因显示不同程度的作用。如在Huntington氏病中，缺陷基因如来自父本则比来自母本的发病要早。类别转换(class switching),3、染色体的扩增 染色体的扩增其本质是指细胞内特定基困拷贝数专一性大量增加的现象称为基因的扩增（amplification）。染色体的扩增可分为几种情况：（1）组织中整个染色体组都进行扩增：哺乳动物肝细胞扩增为四倍体；在双翅
41、目昆虫（如果蝇（D.melanogaster）的唾腺中，细胞不分裂但染色体却多轮复制，产生巨大的多线染色体（polytenne chromosomes）（含多于1000条染色单体）。George Rudkm 早在1960年就指出：果蝇唾腺的多线染色体其常染色质DNA可以特异扩增上千倍，而在异染区附近只可复制几次。,（2）发育中的编程扩增1）特定的基因簇的染色体外扩增：最为人们熟知的例子是两栖类和昆虫卵母细胞rRNA基因的扩增。如非洲爪蟾的每条染色体上有约450拷贝编码18S、5.8S 和28S r DNA的串联重复单位，它们成簇存在，形成核仁形成区。可是在卵母细胞中rDNA串联重复单位被剪切下
42、来后环化，以滚环复制的形式进行扩增，使拷贝数扩大了1000倍以上。为胚胎的发育提供大量的合成装置，直到发育成蝌蚪阶段。在四膜虫中，剪切的rDNA是通过发夹引导复制的，产生一个线性的反向重复元件。,2）特定的基因簇原位扩增：在黑腹果蝇的发育中，卵壳蛋白基因不被剪切，但在基因组中通过复制的重叠环而被扩增。卵壳蛋白是由多倍体的卵泡细胞合成和分泌的。昆虫的卵壳基因成簇排列，在黑腹果蝇中已鉴别出两组。在卵泡中其中一组位于X染色体上的基因，在表达之前经4次重复，扩增了16倍；另一组基因在第 染色体上，它们经6次重复，扩增了64倍。,在这两组中，扩增区域延伸到卵壳基因另一侧约4550 kb。扩增最多的区域是
43、在卵壳基因周围约20kb的区域。产生一系列的协同扩增子(concentric amplicons)。这样通过在卵泡细胞中选择性扩增来满足在短期中对卵壳蛋白的大量需要。,3)哺乳动物培养细胞中定向基因的应激性扩增：某些试剂可使那些对其产生抗性的基因大量扩增。当用药物处理培养的哺乳类细胞来抑制特定的酶时，抗性细胞可以被分离并大量生长。氨甲蝶呤（methotrexate）是二氢叶酸还原酶（DHFR）的竞争性抑制剂，可阻断叶酸盐的代谢。野生型细胞对氨甲蝶呤十分敏感，但在加入氨甲蝶呤后的培养细胞中可以分离到能耐受氨甲蝶呤的细胞。对这种抗性细胞的DNA进行分析，有些是在dhfr基因中发生了突变，突变体改变
44、了活性，使其对氨甲喋呤产生抗性。在经过几轮筛选的高抗性细胞中，这个基因座可能扩增上千倍。在这种高抗性的细胞染色体中，可以观察到扩增区域形成一延伸的染色体带称均匀染色区（homogeneously staining region,HSR）或形成小的点状染色体被称为双微体(double minute chromosomes)。这样类似的基因扩增现已发现20种以上。,dhfr扩增也仅仅发生在二个等位基因中的一个。对氨甲喋呤抗性的增加是依靠这一基因座位扩增的程度来完成的。在抗氨甲喋呤细胞中dhfr基因数目的变化范围是40400拷贝，拷贝数的多少取决于选择的程度和单个细胞系本身。mtxr(metnotr
45、exate 抗性)细胞系分为稳定系和不稳定系两类，二者的差别如图18-3所示。在稳定系中扩增的基因得以保持，因为它们位于染色体上dhfr基因座上（均匀染色区），而其等位基仍保持正常的单拷贝(图18-4)。称其为均染区是由于在染色体上存在着一条增加的区域。用分带技术来处理(如G带)后，这一区域不显示任何染色体带，表明带间的某一区域经历了一种扩增。,均染色区（homogeneously staining region,HSR）,双微体(double-minute chromosomes),在不稳定系统中，当选择压力消除时，扩增的基因至少会部分丢失。但未丢失的是以染色体外的方式（双微体）存在（图18
46、-5）。在典型的细胞系中，每个双微体带有24 dhfr基因。双微体可以复制；但它们没有着丝粒，结果它们不能附着在有丝分裂的纺锤丝上，因此不能均等分离进入子细胞。虽然它的名字叫双微体，实际上可看作为染色体外的微小染色体。,染色体外的拷贝是怎样产生？这有两种可能：（1）复制的附加环可能在dhfr基因附近起始，然后通过dhfr拷贝之间的非同源重组而产生（2）或是等位基因之间的非同源重组来起始这个过程。额外的拷贝可能是通过类似于重组的事件将其从染色体释放出来。2.果蝇卵壳蛋白基因的扩增,六、Britten-Davidson模型,一）Britten-Davidson调节模型 在个体发育期，许多基因可被协
47、同调控，且重复序列在调控中具有重要的作用。参与调控的遗传因子：1、受体位点，位于结构基因5端，可被激活因子激活因子激活。2、整合基因，产生激活因子的基因。3、感受位点，接受生物体对基因表达调控的信号。,通过特定的激活因子可以同时控制不连锁但含用相应受体位点的多个结构基因协同表达。含有相同受体位点的基因组成一组基因，类似原核生物的一个操纵子。而整合基因类似于调节基因，但其转录受感受位点控制。,受体位点类似操纵基因，如果一个结构基因附近具有几个不同的受体位点，各个受体位点可以被特异的激活因子所识别，结构基因能在不同的情况下表达，也就是说一个结构基因可以属于几个不同的组（图10-12B）。,如果一个
48、感受位点可控制几个整合基因，则可同时产生几种激活因子，使不同组的基因也能同时被激活而进行协同表达。,（二）重复序列在协同调控中的作用 真核生物基因表达的协同调控是多级别，也是经济的调控方式，一种信号可以使不同的基因得到协同表达，其基础是整合基因、受体位点上具有重复序列。,第三节、真核生物调节的不同层次,一、转录的调节,二、mRNA剪切的调节,三 mRNA转运的调节,四、翻译的调节,五、翻译后的调节,真核生物的转录和原核是相似的，所不同的在于：原核只有一种RNA聚合酶而真核细胞有三种聚合酶；启动子的结构特点不同，真核有三种不同的启动子和其他与转录有关的元件；真核的转录有很多蛋白质因子的介入。,一
49、、转录水平调节,转录控制(transcriptional control)是真核生物控制基因表达的重要调控方式，通过转录调控，控制着基因在不同组织中进行差异表达。近几年，通过实验比较哺乳动物不同组织细胞核中合成的RNA的差异获得了转录调控的直接证据。下图就是基于这样的思路设计的实验结果。（参看P335，查阅基因表达研究手段的文章，写一篇综述文章作为作业。）,通过杂交实验可证明肝细胞和脑细胞质中mRNA群体的差异：(a)分离肝细胞和脑细胞的细胞质mRNA,然后将在两种类型细胞中都出现的mRNA选择性的剔除，再将肝细胞特异的mRNA反转录成cDNA,制备成肝组织特异的探针。用制备的肝细胞特异的探针
50、对肝细胞核RNA(b)和脑细胞核RNA(c)进行杂交检测，结果与预期的一致：来自肝细胞的核RNA能够与肝细胞特异的探针杂交，而来自脑细胞的核RNA则不能与肝细胞特异的探针杂交，表明在这两种组织中进行了不同基因的差别转录,1、真核生物的RNA聚合酶,真核生物有3类RNA聚合酶，负责转录3类不同的启动子。,由RNA聚合酶I负责转录的rRNA基因，启动子（I类）比较单一，由转录起始位点附近的两部分序列构成。第一部分是核心启动子（core promoter），由-45+20位核苷酸组成，单独存在时就足以起始转录。另一部分由-170-107位序列组成，称为上游调控元件，能有效地增强转录效率。,由RNA聚
