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1、真菌常用的体外药敏试验方法比较,真菌药敏试验临床难以开展的原因,1.按照NCCLS推荐的稀释法,操作繁琐 2.有些药只能用于某种菌的抗菌活性测定 3.纸片法试验未得到NCCLS 认可 4.E试验价钱太贵 5.药敏孵育时间因菌种而不同,体外敏感试验与临床治疗相关性,真菌体外药敏试验结果与口咽部真菌感染结果相关性好对于深部的真菌感染，抗真菌药物敏感性试验同临床治疗的相关性还有待进一步证实 体外敏感试验没有考虑到真菌对抗真菌药物在体内的动力学和复杂的生物学作用,真菌体外药物敏感试验方法,NCCLSM27-A：常量肉汤稀释法，微量肉汤稀释法 E-test法 NCCLS M44-P纸片扩散法(仅限氟康唑
2、)丹麦Rosco纸片扩散法(NCCLS未认可),真菌体外药敏用培养基,常量肉汤和微量肉汤法RPMI1640液制备：RPMI 10.4g MOPS（三氮吗啡啉丙磺酸）34.53 g 蒸馏水900ml溶解后，用1M NaOH调节PH至7.0（25），用蒸馏水溶至1000ml，高压灭菌后，冷却至50 加入RPMI1640用0.22m滤膜抽滤除菌，4保存。,真菌体外药敏用培养基,E-test法：在RPMI液体培养基中补充葡萄糖，使其终浓度为2%。NCCLS纸片扩散法：Mueller-Hinton 琼脂 补充2%葡萄糖和0.5g/ml美蓝 丹麦ROSCO纸片扩散法：改良的SHADOMY（PH7.0）培养
3、基 主要成分：酵母粉，葡萄糖，天冬氨酸，磷酸缓冲液等。,菌液制备,将受试菌在沙保罗培养基上转种，以保证其纯度和活性。用0.85%的盐水制成酵母菌悬液，调整其浊度达到0.5麦氏比浊标准（约为15106CFU/ml）。常量稀释法：用RPMI1640液体稀释2000倍 接种浓度约为0.52.5103CFU/ml 微量稀释法：用RPMI1640液体稀释1000倍 接种浓度约为15103CFU/mlE-test法和NCCLS纸片扩散法：用菌液浊度为0.5麦氏单位。Rosco纸片扩散法：1.念珠菌：0.5麦氏浊度，生理盐水1：10稀(15105CFU/ml)2.隐球菌属：1.0麦氏浊度3.其它酵母菌：0.
4、5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释,常量肉汤法(M27-A),先将氟康唑粉末溶于蒸馏水，然后用配制好的RPMI1640液倍比稀释，使其起始浓度为640g/ml,终末浓度为1.25g/ml，分装无菌洁净的12mm75mm试管：,64,32,16,8,4,2,1,0.5,.25,.125,前10管：0.2ml氟康唑1.8ml菌液念珠菌属 35 孵育48小时新型隐球菌 72小时 读取MIC结果,2ml菌液,1.8ml1640,常量稀释法 药敏结果判定,氟康唑，伊曲康唑，两性霉素为100%抑制其他唑类药物为80%抑制（取0.2ml的生长对照菌液加入0.8mlRPMI液体培养基的菌液浓度）质控株 克柔念珠菌
5、ATCC 6258 近平滑念珠菌ATCC 22019 白念珠菌ATCC 90028 白念珠菌ATCC 24433,微量肉汤法,氟康唑的稀释方法同常量法，但起始浓度为2常量法的浓度（即128g/ml），终浓度为0.25g/ml。,。37,。37,64,32,16,8,4,2,1,.5,.25,.125,氟康唑：1-10孔分别为 100ul菌悬液：1-10孔分别为 100ul,200ulRPMI汤,200ul菌悬液,35 新型隐球菌72小时，其余菌株 48小时读取MIC结果,酵母菌的NCCLS M27-A各药物折点,粘膜及系统性感染：氟康唑（除克柔念珠菌）敏感：8g/ml 中介：耐药：64g/ml
6、粘膜感染：伊曲康唑 敏感：0.125g/ml 中介：耐药：1g/ml粘膜及系统性感染：5-氟嘧啶 敏感：4g/ml 中介：816g/ml 耐药：32g/ml,酵母菌E-test法,瑞典AB Biodisk 优点：有较好的重复性和稳定性,MIC,E-test法,0.5麦氏比浊液（约为15106CFU/ml）。菌悬液均匀涂布于药敏板上 35 培养24小时读取结果 光滑念珠菌 新型隐球菌等生长较慢的菌种需适当延长培养时间。,E-test法评价,准确性高,且操作简便 E-test法得到的MIC值在某些菌种中要低于NCCLS推荐的常量肉汤稀释法测得的MIC 20%浓度CO2的环境中，可使此方法的结果更真
7、实反映药物对致病菌的敏感性 缺点：1.价格太高 每片40-50元 2.吡咯类MIC终点不好确定,酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P.2003,培养基：Mueller-Hinton琼脂 补充 2 Glucose 0.5ug/ml Methylene blue dye优点：有较好的重复性和稳定性 操作简便，价廉缺点：目前只限氟康唑,NCCLS纸片扩散法,0.5麦氏比浊标准（约为15106CFU/ml）。菌悬液均匀涂布于药敏板上步骤同细菌敏感试验操作一致，3537孵育1824小时，对于生长缓慢的菌株如新型隐球菌，菌液需 调至1麦氏单位，孵育48小时，光滑念珠菌也需孵育48小时读取抑菌环
8、直径。,酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P.2003 氟康唑解释标准和相应的最小抑菌浓度,SSusceptible SDD=SusceptibleDose Dependent R=Resistant,酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P.2003,氟康唑对标准菌株 24h抑菌环直径（mm)的质控允许范围标准菌株氟康唑25ug 沃尔康唑1ug白念珠菌 ATCC9002828-39 31-42近平滑念珠菌 ATCC2201922-33 28-37热带念珠菌 ATCC75026-37 克柔念珠菌ATCC6258 16-25,ROSCO纸片扩散法,ROSCO纸片扩散法：1.克
9、柔念珠菌：0.5麦氏浊度，生理盐水1：10稀释菌液为5105CFU/ml2.隐球菌属：1 麦氏浊度3.其它酵母菌：0.5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释菌液为2.5106CFU/ml将稀释好的菌液涂布在改良的SHADOMY（PH7.0）培养基上其它操作同细菌。,读取抑菌环直径近似到mm 在大约80%抑制区为测量边界 在抑菌环内个别细小或中等大小的菌落，15可忽略不计,Rosco纸片扩散法药敏结果判定,两种纸片扩散法的比较,Rosco纸片扩散法检测菌种 念珠菌属，隐球菌属培养基 改良SHADOMY琼脂，PH7.0试验药品及剂量 AMB 10g，IT 8g，FLA 15g，FC 1，10g，FC 10
10、g，KET15g等接种的菌量：5105CFU/ml（克柔念珠菌先制成 0.5麦氏浊度，再用生理盐水1：10。隐球菌属配1.0麦氏不稀释）其它菌种配0.5麦氏浊度，1：1稀释培养条件 念珠菌属35培养1824小时，新型隐球菌30培养4248小时结果判读 FC及AMB100%被抑制 唑类药物80%抑制 质控株 光滑念珠菌2238NL 白念珠菌ATCC64548 白念珠菌ATCC64550,NCCLS纸片扩散法 检测菌种 念珠菌属，隐球菌属培养基 Mueller-Hinton 琼脂中补充2%的 葡萄糖和0.5g/ml的美蓝试验药品及剂量 FLA 25g接种的菌量 1 5106/mL隐球菌 1.0麦氏
11、浊度培养条件 35 孵育1824小时 新型隐球菌培养4248小时结果判读 FC及AMB100%被抑制，唑类药物80%抑制质控株 白念珠菌ATCC90028 近平滑念珠菌ATCC22019,Rosco纸片扩散法各药物折点,粘膜酵母菌感染氟康唑，克霉唑，酮康唑，氟胞嘧啶1ug，特比奈吩，咪康唑等 敏感：20mm 中介：1219mm 耐药：11mm两性霉素B，制霉菌素伊曲康唑 敏感：15mm 中介：1014mm 耐药：无抑菌环氟胞嘧啶10ug 敏感：30mm 用于黑曲霉 中介：2329mm 耐药：22mm灰黄霉素 敏感：10mm 中介：耐药：无抑菌环,系统性酵母菌感染氟康唑15ug 18-24h 敏
12、感：30mm 4 中介：2923mm 8-16耐药：22mm 32 伊曲康唑 8ug 18-24h 敏感：20mm 0.06中介：1912mm 0.125耐药：11mm 0.25 这个MIC标准为纸片法的相应值,Rosco纸片扩散法各药物折点,系统性酵母菌感染 酮康唑 15ug 纸片和培养基广州乐通公司可供应 敏感：30mm 0.12中介：23-29 0.25耐药：22mm 0.5 两性霉素 10ug 敏感：15mm 1中介：14-10 2 耐药：9mm 4氟胞嘧啶1ug 敏感：20mm 4中介：12-19 8-16耐药：11mm 32氟胞嘧啶10ug用于黑曲霉 敏感：30mm 4中介：23-29 8-16耐药：22mm 32,Rosco纸片扩散法各药物折点,两性霉素B,克霉唑-,特比奈酚,结论,1.常量稀释法难以推广2.微量板浪费3.NCCLS纸片法只做氟康唑 4.建议目前用Rosco纸片5.寄希望将来推行Etest 法,
