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1、,实验一 工作曲线绘制 及维生素B12含量的测定,一、实 验 目 的1、了解紫外吸收光谱在有机结构 分析的应用。2、学习有机物的定量分析方法。,比耳定律 当入射光的波长、液层厚度和溶液的温度固定时,溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。,朗伯特定律 当入射光的波长、溶液的浓度及温度一定时,溶液的吸光度与液层的厚度成正比。,二、实验原理,许多有机化合物在紫外具有特征的吸收光谱，从而可以用来进行有机物的鉴定及结构分析（鉴定有机化合物的官能团）；此外，还可对同分异构体进行鉴别。对具有健电子及共轭双键的化合物特别灵敏，且在紫外光区具有强烈吸收。该法在有机物分析中可进行：（1）纯度检查；（2）未知样品的鉴定；
2、（3）分子结构的推测；（4）互变异构的判别；（5）定量测定。,维生素B12是一类含钴的卟啉类化合物，具有很强的生血作用，可用于治疗恶性贫血等疾病。维生素B12不是单一的一种化合物，共有七种。通常所说的维生素B12是指其中的氰钴素，为深红色吸湿性结晶，制成注射液的标示含量有每毫升含维生素B12 50、100或500mg等规格。维生素B12的水溶液在2781nm、3611nm与5501nm三波长处有最大吸收。361nm处的吸收峰干扰因素少，药典规定以3611nm处吸收峰的比吸光系数E值（207）为测定注射液实际含量的依据。,三、仪器组成 紫外-可见光度计仪器由光源、单色器、吸收池和检测器四部分组成
3、。,1、光源 对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。（1）钨及碘钨灯：3402500 nm，多用在可见光区；（2）氢灯和氘灯：160375nm，多用在紫外区。,2、单色器(Mnochromator)与原子吸收光度仪不同，在 紫外可见分光光度计中，单色器通常置于吸收池的前面！(可防止强光照射引起吸收池中一些物质的分解),单色器：是分光光度计的关键部件，主要任务是将光源发来的混合光分解为单色光，并提供所需波长的光。,3、吸收池(Cell，Container)：用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池
4、。,4、检测器：硒光电池 光电二极管 光电倍增管,四、实验仪器与试剂1、仪器：UV-2501型紫外-可见分光光度计（Simazu公司）；1cm 石英比色皿2、试剂：维生素B12注射液：100mg/ml,五、试剂配制与测定,1、配制标准系列：取维生素B12标准溶液100mg/mL 0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL分别置于50.00mL 容量瓶中，用水稀释至刻度；2、绘制标准曲线：用1cm 石英比色皿，以空白为参比，在波长200600nm 内测定标准溶液316nm处的吸光度A，绘制标准曲线。3、测定未知液：取未知液5.00mL 置于50.00mL 容量瓶中，用水稀释至刻度；用1cm 石英比色皿，测定316nm处吸光度A，以空白为参比。4、计算未知液的含量（mgmL-1）。,六、仪器安装环境,七、仪器使用注意事项：,仪器操作过程出现异常情况，不得私自关闭电源，需由教师指导完成。实验室内不准来回跑动。不准随意搬动仪器。在测量状态下，不得将手伸入测量室内，以防紫外线灼伤！不准私自调整实验室空调的设定温度及风速。同学操作时请注意爱护仪器，如有人为损坏需照价赔偿。,八、思考题：,为什么同浓度溶液，每次测量后读数会发生细微变化？紫外分光光度法与可见分光光度法有些什么区别？,
