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1、一、分光光度法的特点二、可见分光光度法与紫外的区别三、分光光度计测定物质含量的原理四、工作曲线法测定芦丁含量五、本次实验注意事项六、仪器的操作,讲 解 提 纲,分光光度法的特点（包括紫外和可见）分光光度法与其他测定方法比较有这样一些特点1、首先，它的应用广泛，在国际上发表的有关分析的论文总数中，分光光度法占28%，我国约占所发表论文总数的33%。2、灵敏度高，由于新的显色剂大量合成，并在应用研究方面取得了重要进展，使得测定物质的灵敏度提高。3、选择性好，目前有些元素只要控制适当的显色条件就可以直接进行光度法测定。4、准确度高，浓度测量的相对误差在13%范围5、分析成本低，操作简便快速。,可见分
2、光光度法与紫外的区别：,1、光源不同，紫外用氢灯作光源，可见用钨灯 2、测定波长不同，紫外波长范围180350nm 可见波长范围32010003、可见需显色，紫外不需显色 可见分光光度测定中通常是被测物质与显色剂反应，生成有色物质，然后测定其吸光度，进而求得被测物质的含量。,分光光度计测定物质含量的原理：（紫外与可见基本相同）均采用一个能产生多个波长的光源，通过系列分光装置后产生特定波长的光源，光源透过被测样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，由比尔-朗白定律求得样品的浓度。,实验八 工作曲线法测定芦丁含量,可见分光光度法,一、实验目的,（1）掌握可见分光光度计的使用（2）掌握光电比色的一
3、般操作。（3）学会用作图法及计算器回归 法求芦丁样品的浓度,芦丁又名芸香甙，维生素P，属黄酮类化合物，临床上主要用于治疗脑溢血，高血压，视网膜出血等疾病。芦丁的含量测定有高效液相色谱法，紫外分光光度法和可见分光光度法。,黄酮类化合物的结构性质结构中含有酚羟基和环酮基结构，可与某些金属盐试剂生成有色络合物，在510nm波长处有吸收，用可见分光光度计测其含量。,二、实验原理,本实验利用什么原理本实验利用黄酮甙与亚硝酸钠、硝酸铝反应在碱性时显红色的反应测定芦丁的含量。,1 显色反应的完全程度（取决于）：介质的pH显色剂的用量反应温度反应时间,要使得测定浓度准确应当考虑影响测定准确的因素：,2 吸光度
4、的物理测定条件,如何确定反应最佳条件在建立方法时，需要通过实验确定最佳反应条件，为此改变其中一个因素（例如介质的pH值暂时固定其他因素，显色后测量相应溶液的吸光值，通过吸光度-pH曲线确定反应的酸度范围，其他几个影响因素的适宜值也可以按这一方法分别确定。,三、实验内容,仪器 光电分光比色计 使用方法见附件比色皿的校核 将同样厚度的四个比色皿分别编号标记，都装空白溶液，在所用波长（510nm）下比较各比色皿的透光率，应相同，若有显著差异，应将比色皿重新洗涤后再装空白溶液测试，经洗涤可使透光率的差异减小时，可通过多次洗涤使透光率一致。若经几次洗，仍然不一致可如下校正：以透光率最大的比色皿为100%
5、透光，测定其余各皿的透光率，分别换算成吸收度作为各比色皿的校正值。测定溶液时，以上述100%透光率的比色皿作空白，用其他各皿装溶液，测得吸收度值然后碱去所用比色皿的校正值。,芦丁的测定（标准曲线制备与芦丁测定一起完成）精密移取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml和样品液3.0ml置10ml容量瓶中各加30%乙醇使成5.0ml各精密加入亚硝酸钠溶液（120）0.3ml,摇匀，放置6分钟各加硝酸铝（120）0.3ml,摇匀，再放置6分钟。各加氢氧化钠试液4ml,用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置15分钟。在510nm波长下测定各瓶溶液的吸收度（以第一瓶作空白）以浓度为横坐标，吸收
6、度为纵坐标，绘制标准曲线。测定样品的浓度。,芦丁的测定各试剂用量,结果1、列出浓度C与吸光度A对应表格2、用作图法绘制芦丁工作标准曲线3、用计算器回归求标准曲线方程A=()C+(),要求r=0.998以上4、从图中读出芦丁的浓度,并计算瓶中芦丁样品的浓度5、计算器回归求芦丁样品的浓度并计算瓶中芦丁样品的浓度。,注意事项,移液管,容量瓶的正确使用NaOH每吸一次可以放两个,比色杯不要甩容量瓶易翻倒,注意放好注意放的时间NaNO2加0.3ml,不是0.03ml.标准浓度看黑板,各浓度要计算蒸馏水要加至刻度后摇(用滴管),容量瓶拿在手上看刻度浓度的测定,以1号为空白,从低浓度至高浓度来测.数据当场交
7、,报告回去做.,四、思考题相同厚度的各比色皿透光性不一致时，为什么要在经过多次洗涤后各皿透光率差异无改变下才使用校正值？工作曲线法和标准对比法分别适用何种情况？从本实验结果看，能否用标准对比法？,仪器的操作,1、预热：仪器开机后灯及电子部分需热平衡，故开机预热30分钟后才能进行测定工作2、调零：目的：校正基本读数标尺两端（配合100%T调节）进入正确测 试状态 调整时机：开机预热30分钟后，改变波长或测试一段时间，以及做高精 度测试之前 操作：将拉杆拉出半格（或打开盖子）遮断光路，然后按“0%”键，即能自 动调整零位3、调整100%：目的：校正基本读数标尺两端（配合调零）进入正确测试状态 调整时机：同上 操作：空白样品置入样品室光路中，盖下盖子（打开光门）然后按“100%T”键，即能自动调整100%。4、调波长：用、箭头调节波长，调至所需波长,标准曲线：一份称样量，但是可以定量很宽的线性范围；中间可能存在的误差-称样时引入的误差标准对照法：2份或者2份以上的称样量，只能定量90-110%的含量，且不能存在较大的截距,
