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1、肿 瘤 细 胞 培 养 技 术解放军总医院免疫室林星石研究员,Histroy,肿瘤类型：间充质 上皮 神经外胚层 造血源性（1955-1958-1963-1965）In vitro:原代 传代 建系（1967-1970）配基成分：纯血清 含血清 无血清生物学特性：细胞 亚细胞 酶和分子,肿瘤细胞in vitro的特点,细胞保持永生性：自我复制形态学：大小不一 逐渐一致增殖力更强：DNA合成期、分裂期达50%突变性：不同于正常细胞，失去稳定的控制高分化 变低分化表面性状：负电荷数量正常，贴壁性，抗原性可 变异接触抑制减弱或消失：悬浮生长特征：成瘤性：移植到动物体内可成瘤,肿瘤细胞in vitro
2、 培基,RPMI1640：最常用，+1020%FCS，上皮性 或悬浮性（+0.03%谷氨酰胺）DMEM：常用F12：适用于上皮性癌，如肝癌，L-15：注意：+2g/L NaHco3 或+20mmol/L HEPESpH7.2RPMI1640+F12或L-15（1:1）：适用肉瘤,培养液特殊添加剂,常用的促细胞生长因子及使用的终浓度 添加剂 终浓度 添加剂 终浓度 BSA 10-5mol/ml EGF 5ng/ml transferrin 5-10 g/ml FGF 5ng/ml insulin 5 pg/ml NGF 5ng/ml 氢化可的松 10-5mol/ml,肿瘤细胞的培养,与常规细胞培
3、养技术相同 一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性建株细胞较正常细胞易于培养,细胞分裂增殖的调控（细胞周期）,多种基因的协同作用调控因子：基因：Cdc2、cyclin 蛋白磷酸化 蛋白激酶的调控 胸苷激酶的调控 负调：DNA损伤与DNA修复：抑制抗性 肿瘤细胞,细胞间的相互影响,不同亚群代表不同分化程度的细胞群 表型、形态、受体、对因子的反应等 均不同不同亚群释放不同的正负调节因子(阴阳调控),细胞因子与激素对肿瘤细胞的调控,一个重要而复杂的因素 因素 高分化 低分化胰岛素 生长-凝血孝素 生长-前列腺素 促进（400)抑制激情素-助黏附维生素A 抑制生长及分化_调整培基中的成分可调控细胞的生长与
4、分化,影响培养肿瘤细胞生长的因素,PH营养：如血清效价低细胞生长因子的自分泌及旁分泌癌基因抑癌基因的变化排泄废物的影响细胞外基质的作用细胞相互间的作用污染,培养技术-取材,手术标本活检标本胸腹水穿刺细针头穿刺内窥镜活检 关键：新鲜、无菌、及时、准确,技术-分离纯化,分离：剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等 密度沉降分离纯化：反复贴壁去除成纤维细胞 自然淘汰去除正常细胞 利用特异抗原标志筛选法(panning)分亚型 流式细胞仪分选 克隆建株 高转移株的建立：反复接种,技术-培养,原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞，防止细菌、真菌污染。传代培养：增殖力低的细胞需要饲养 细胞适当密度,基本
5、长满后 传代,前10代不稳定，注意 培养条件，适当调整培基。,技术-鉴定与建株,鉴定：组织来源、形态特征、核型染色体分析、生长特性、对细胞因子的反应（TNF)、集落形成、致瘤实验（裸小鼠）建株：生长半年以上，病理诊断、光镜及电镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、致瘤及转移情况注意：不是每一肿瘤组织都能建株,应用-肿瘤治疗的研究,治疗药物敏感性的鉴定与筛选肿瘤的多药耐药性的鉴定各种新药治疗的实验研究 体外：肿瘤的生长（3HTdr掺入）肿瘤的杀伤率（MTT、51Cr释放）体内：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤 生长率、转移率、生存时间及死亡率 作用机理的研究：基因、蛋白、酶、标志、受体,肿瘤
6、细胞培养的应用,肿瘤细胞的遗传特性：各种癌基因及抑癌基因的分析、染色体定位（FISH法）肿瘤细胞的生物学行为：细胞周期（FACS)、信号传递肿瘤细胞的标志与激素、受体变化（免疫细胞化学、放射自显影、酶免疫、荧光免疫、放射免疫、免疫印迹）,单克隆抗体的制备,单克隆抗体的制备,基本原理：Bunet抗体选择学说，每个B细胞只能够产生一种针对它的特异性抗原决定簇的抗体。从一个祖先B细胞分裂繁殖形成的纯细胞系，称为克隆。,单克隆抗体的制备,单克隆抗体定义：来自克隆系的细胞基因完全相同，产生的抗体完全相同。这种从一株克隆系产生的抗体 单克隆抗体（McAb)。1975年Kohler 和 Milstein 首
7、先利用细胞融合技术制备了永久分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。,单克隆抗体的制备,特点：肿瘤细胞易体外培养和长期生长；B淋巴细胞 分泌特异性抗体；二者杂交融合杂交瘤，继承二者性质。HAT培基：H次黄嘌呤、A氨基蝶呤 T胸腺嘧啶核苷,单克隆抗体的制备,肿瘤细胞DNA合成途径：叶酸衍生物 氨基酸、小分子化合物合成DNA HGPRT-TK 次黄鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 胸腺嘧啶核苷激酶 核苷酸前体,单克隆抗体的制备,HAT特点：“A”叶酸拮抗物骨髓瘤-骨髓瘤：DNA合成途径阻断；缺HGPRT，不能利用“H”死亡。脾细胞-脾细胞：有HGPRT，缺增殖能力死亡。骨髓瘤-脾细胞：HGPRT+无限增殖能力 存活。,
8、单克隆抗体的制备方法,抗原：纯度、分子量。1.细胞121072.可溶性蛋白质抗原10 100 g动物：BALB/C鼠，周龄：68周，雌性佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、脂质体,免 疫 方 法,1.常规免疫：腹腔或颈部多点皮下 0 天：基础免疫抗原+完全佐剂 15天：基础免疫抗原+不完全佐剂 30天：基础免疫抗原+不完全佐剂 45天：追加免疫同量抗原 48天：进行细胞融合,免 疫 方 法,备注：1.细胞、细菌、病毒等颗粒性抗原有较强抗原性，可不加佐剂，直接腹腔注射。2.可溶性蛋白质抗原需加佐剂。本研究室经验：,免 疫 方 法,2.脾内免疫：2.1 0 天：基础免疫 15 天：脾内免疫 18
9、天：细胞融合2.2 0 天：脾内免疫 4 天：细胞融合,免 疫 方 法,脾内免疫优点：时间短，使用抗原量少。可溶性抗原：210g 细胞抗原：1 105缺点：效果差于常规免疫，尤其无基础免 疫的脾内免疫。,免 疫 方 法,脾内免疫方法：BALB/C小鼠乙醚麻醉，右卧位，消毒，无菌操作剪开皮肤，透过腹膜，用 4号针头注射器注入脾脏，尽量刺深，勿刺透，纵轴方向，边退边注射或多点注射。注意事项：抗原体积 0.2 ml，脾内逐步注射后，针头拔出口时要停留片刻，缝合切口或用医用黏合剂涂抹切口。,免 疫 方 法,3.弱免疫原免疫方案；0 天：基础免疫 30 天：基础免疫 45 天：基础免疫 60 天：基础免
10、疫 75 天：基础免疫 6个月内，至鼠血清测出抗体产生。静脉 或脾内追加免疫后7296h细胞融合。,免 疫 方 法,4.体外免疫：分离小鼠脾细胞，置 10%20%FCS RPMI1640培基，加适量滋养细胞与抗原（可溶性抗原 0.5 5 g/ml；细胞性抗原10 5106/ml），37，5%CO2 培养 3 天，再分离淋巴细胞与骨髓瘤细胞，融合。,单 克 隆 抗 体 制 备,一.滋养细胞制备：1.机制：不明，通常认为这类细胞释放 一种或几种生长因子，提供必要生长 条件。2.小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞 正常无感染BALB/C小鼠，处死。75%乙醇浸泡 510min，,单 克 隆 抗 体 制 备
11、,撕开腹部皮肤，充分暴露腹腔，提起 腹膜，剪开，吸管注入5 ml无血清培基，小心提动或轻揉腹膜，吸出培基。无血清培基洗2次，细胞浓度2105/ml,0.1 ml/孔/96孔，相当于 2104。通 常获2106 5106 只。,单 克 隆 抗 体 制 备,二.骨髓瘤细胞准备：Sp2/0,NS-1等1.复苏，20%FCSRPMI-1640培基为好。2.培养、传代，取对数生长期细胞（1105 5 105/ml），按1：5 1：10 稀释传代，2、3天扩大培养，选生长状态、形态好对数生长期细胞融合用。3.RPMI-1640培基洗3次（1000r/min 5min),单 克 隆 抗 体 制 备,注意事项
12、：1.骨髓瘤细胞的细胞活数应在95%，2.无各种污染，3.骨髓瘤细胞质量保证、生长密度合适。,单 克 隆 抗 体 制 备,三.免疫脾细胞悬液制备：1.免疫BALB/C鼠，放眼血致死（收集眼血制成血清）。2.浸泡于75%乙醇515分，入超净台，打开腹腔（逐次换器械），取脾。3.剪碎脾脏，注射器内芯研磨过100目钢筛，平皿预先23ml RPMI-1640，移入圆底试管，补加适量培基，静置35分，取上2/3悬液移入50ml离心管，上述反复23次。,单 克 隆 抗 体 制 备,三.免疫脾细胞悬液制备：5.上述培基洗细胞2次（1000r/min 10 min），6.不完全培基10ml重悬液，台盼蓝计数活
13、 脾细胞数，1 10 8 2.5 10 8/只。,单 克 隆 抗 体 制 备,四.50%PEG的准备：融合前，称PEG（mw=4000)2g，置小瓶内，低压消毒（8磅），15min,取出立即边加边摇加入2ml完全培基，（内含0.3%ml二甲基亚枫，以提高融合率），至完全混合，4 保存。用前37 预热。要求PEG现配，防止PH变碱。,单 克 隆 抗 体 制 备,五.细胞融合：1.将准备好的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于 50ml离心管内（脾细胞1 10 8，骨髓瘤细胞1 10 7）。用SP2/0时，脾细胞：骨髓瘤细胞以10：1为好；用NS-1，脾细胞：骨髓瘤细胞以5：1为好。,单 克 隆 抗 体 制
14、备,2.RPMI-1640培基洗2次（1500r/min/8min）；3.倾倒上清，吸尽残留液，轻弹管底，使细胞疏松，离心管移至超净台预先放置的37 水浴。4.1 ml 吸管吸取 0.8 ml 37 PEG，110 8 脾细胞+0.8 ml PEG，边加边摇，60s内加完，轻摇1.5 min。5 min内摇动缓和加入10 ml 预 温37 的RPMI-1640。,单 克 隆 抗 体 制 备,注意：第1 min 加 1 ml;第2 min 加 1 ml;第3 min 加 1.5 ml;第4 min 加 1.5 ml;第5 min 加 5 ml;再补加40 ml。离心：1000r/min/5min
15、.,单 克 隆 抗 体 制 备,5.移出上清，取少量HAT小心吹散细胞，细 胞移入HAT培基中，按免疫脾细胞210 5/孔/96孔，加入 0.1 ml 0.2 ml/孔（已加入融合当天制备的滋养细胞），CO2 孵箱 37。提示：接种1012块96孔板，使80%杂交瘤生长为单克隆，减少克隆化次数，阳性孔不易丢失。,单 克 隆 抗 体 制 备,六.融合细胞观察与换液：1.第23天骨髓瘤细胞退化、核缩、碎裂，增生、吞噬碎片；第45天可见小堆杂交瘤细胞生长。记录。2.融合后57天确认骨髓瘤细胞全部死亡，毛细吸管吸出0.1ml 0.15ml HAT，换成同量HT培基。,单 克 隆 抗 体 制 备,七.杂
16、交瘤抗体检测：培基变黄，杂交瘤细胞占孔底面积1/4、状态好，可测上清液抗体（非分泌性比分泌性杂交瘤长速快），及时测抗体及时克隆化，以免目的杂交瘤丢失。测定时间：融合后1015天，第次换液3天后，ELISA、冰冻切片荧光技术等。阳性孔杂交瘤转入24孔板，1天后细胞状态 好即可克隆化。,单 克 隆 抗 体 制 备,八.克隆化：有限稀释法。1.按前述准备新鲜滋养细胞用HT培基接种 96孔板，0.1ml/孔。2.向24孔板加0.9 ml/孔HT，通常每个待克隆杂交瘤需34孔。3.用1ml吸管吹散待克隆的杂交瘤细胞，取适量加入含0.9mlHT24孔板第孔，混匀，吸0.1ml加入第孔，同法稀释第3孔、第4
17、孔。4.混匀第1孔细胞计数。,单 克 隆 抗 体 制 备,5.计数后从相应孔取100个细胞（如第3孔细胞计数为1.210 3，则从第3孔取100/1.2 1030.083ml），加入10ml HT，接种预先加入滋养细胞96孔板，0.1ml/孔，每孔约1个杂交瘤细胞，总量0.2ml/孔。6.910天测抗体，阳性孔转24孔板，13天后第2次、第3次克隆，直至阳性率100%。7.克隆化后HT逐渐换成RPMI-1640，1/2递减,FCS 浓度递减5%至10%15%。,8.细胞冻存：阳性杂交瘤尽早冻存。24孔板阳性孔应再分出1孔，待第2孔 生长良好，长满孔底，收集第2孔细 胞冻存。建株后每株冻存58管。,单克隆抗体免疫学测定,1.Ig单克隆抗体亚型测定2.单抗对应抗原特性分析：理化性质、分子量。3.单抗等电点测定4.单抗亲和力测定,
