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1、第8章 细胞重组与细胞融合,细胞重组：是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，在体外进行重新装配成为具有生物活性的细胞的一种技术。核体：是与细胞质分离后得到的带有少量细胞质并包有质膜的细胞核，也称为小型细胞。胞质体：是除去细胞核后由质膜包裹的无核细胞。,第一节 细胞质工程,细胞质工程：是研究真核细胞的核-质关系以及细胞器、细胞质基因转移的技术。,一 细胞破碎1 细胞破碎技术：是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物释放出来的技术。2 细胞破碎方法超声波破碎法反复冻融法高速组织捣碎法化学裂解法生物酶解法,超声波破碎法 利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液，由发生器和换
2、能器组成。反复冻融法 将细胞放在低温下冷冻，然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。高速组织捣碎法 借助高速组织捣碎机使细胞被高速旋转的叶片打碎。化学裂解法 通过化学药品改变细胞膜的通透性，使其裂解。生物酶解法 利用溶解细胞壁的酶处理细胞，破坏细胞壁，使细胞内含组分释放。,二 细胞器及细胞组分分离分离方法差速离心法密度梯度分离法,在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。速度逐渐提高，样品按大小先后沉,差速离心,差速离心,在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而
3、且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复23次效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。,密度梯度离心,用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。,密度梯度离心,速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒（细胞或细胞器）在十分平缓的
4、密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。等密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。,第二节 细胞融合,一细胞融合的发展1838-1875年：在血液组织中发现有多核细胞；20世纪50年代：日本科学家发现仙台病毒可以引起细胞的融合；1965年：英国的科学家海
5、利斯成功得到了融合细胞；1964年：HAT选择培养基应用于融合细胞的选择；1974年：加拿大华裔科学家高国楠发现聚乙二醇（PEG）能够促使 植物的原生质体融合；1982年：出现了电融合技术；近20年：从细胞融合的理论和实践两个方面进行了大量研究，细 胞融合的方法不断更新和完善，融合率逐步提高。,二 细胞融合的定义 细胞融合(Cell fusion)：又称体细胞杂交，是指使用人工方法使两个或两个以上的体细胞合并形成一个细胞，使之分化再生，形成新物种或新品种的技术。人工方法：是指在外力使用诱导剂或促融剂、电场、磁场、超声波、重力、激光等因素的作用。无性方式：是区别于有性方式而言的，有自然条件下，生
6、殖细胞卵子和精子相互接触会发生细胞融合的现象。,细胞融合过程：异核体阶段：异核体是指在融合细胞内含有来自两个亲本的细胞核。杂种细胞形成阶段：当异核体同步进入有丝分裂后，核膜崩溃，来自两个细胞核的染色体结合在一起。,三 细胞融合的意义改造细胞遗传物质 生产抗肿瘤疫苗 生产单克隆抗体 用于基因定位用于动物育种 有利于基础理论研究,选择3个都保留有4条人染色体的杂种细胞克隆，但染色体各不相同。如果某一表型特征只出现于克隆A、C而不见于B，就可决定该特征的基因只能在3号染色体上。A、B而不见于C，就可决定该特征的基因只能在2号染色体上B、C而不见于A，就可决定该特征的基因只能在5号染色体上,四 细胞融
7、合基本原理1 细胞膜表面亲水性结构糖蛋白 细胞融合的关键是要脂双层的接触，就是要去除糖蛋白，露出无糖蛋白覆盖的区域，使两个细胞的脂双层能紧密结合。引起细胞膜表面的蛋白起作用细胞相互凝集膜蛋白质分子重排脂类分子重排打开质膜细胞融合,2 病毒促进细胞融合 很多病毒都具有凝集细胞的能力，其原理大致如下：病毒的一边黏接在一个细胞表面，该病毒的另外一边黏接在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。仙台病毒促进细胞融合的有效部位在于它的膜，病毒被膜上的两种糖蛋白（HANA蛋白质和F蛋白质）可和细胞膜表面的糖蛋白发生作用，相互结合，在电镜下观察到在相接触的相邻细胞表面之间产生一些微小的细胞
8、质桥。,3 化学诱导细胞融合（聚乙二醇PEG）PEG含有醚键、带负电性 可与细胞表面正的极性集团相连引起细胞膜表面的蛋白起作用细胞相互凝集膜蛋白质分子重排脂类分子重排打开质膜细胞融合PEG和水之间的氢键相结合，使溶液中的自由水消失，导致细胞脱水而发生膜结构的变化细胞相互凝集膜蛋白质分子重排脂类分子重排打开质膜细胞融合,4 电场诱导细胞融合 低压交流电场中，细胞聚集成串珠状紧密排列相互接触的细胞膜之间会出现无蛋白颗粒的脂质区当受到电击时，这个区域就会被击穿，产生脂双层膜孔，导致细胞之间的细胞质连通发生细胞融合。细胞置于非常高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，这一现象称
9、为电穿孔。,五 杂种细胞特性的表现形式互补作用：亲本细胞的性状同时在杂种细胞中表现。激活作用：亲本细胞的不活动基因在杂种细胞表达。如只能合成RNA而不能合成DNA的小鼠巨噬细胞，与Hela细胞融合，融合后的细胞则可以合成两种核酸。,消失作用：亲本细胞的性状在杂种细胞中消失。如金黄仓鼠的黑色素瘤细胞可产生黑色素，小鼠的成纤维细胞不能产生黑色素，它们的杂种细胞不能产生黑色素。同时具有激活和消失作用 如小鼠的胸腺细胞具有t12抗原基因和h2抗原基因，在胚胎发育早期t12基因表达，h2基因不表达，在成年小鼠中h2基因表达，t12基因不表达，而在成年小鼠的胸腺细胞与小鼠胚胎性瘤细胞融合的杂种细胞中，h2基因不表达，却激活了t12基因，使其表达。,六 细胞融合的影响因素动物细胞融合1 细胞种类和性质 细胞表面性质 细胞种类2 环境条件的影响 温度：pH：最适为 氧气含量：耗氧量较大，一般大于20%3 离子强度及离子种类 细胞融合时需要Ca 2，最适为0.1mol/L,植物或微生物细胞融合1 PEG诱导融合的时间2 PEG纯度3 融合密度 一般为2x1048x104个/ml4 融合液中加入少量的CaCI25 其他添加组份,七 融合细胞的筛选 抗药性筛选系统 营养互补筛选系统 温度敏感突变型融合细胞筛选 物理特性筛选 荧光表记法 酶缺陷型细胞所建立的杂种细胞筛选,
