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1、荧光定量PCR的原理及临床应用,苏晓霁,如何做一个“聪明”的实习生,实习的目的就是对在校所学的理论知识和实验技能，在临床的实际工作中进行实践、巩固和提高。如何做到：实习之前要复习理论知识和实验课内容“理论先行”实习过程中要“聪明”做好实习笔记，用心思考，实习之外下功夫,如何做一个“聪明”的实习生,聪明,耳：认真听老师的说明和讲解,看：仔细看老师的操作,问：有疑问要多提问，多讨论,心：要用心去思考,日月：要每天每月坚持做到,内容概要,PCR的定义和原理荧光定量PCR的原理和分类荧光定量PCR结果的分析荧光定量PCR在临床的应用,PCR的定义,PCR是Polymerase Chain Reacti
2、on的缩写，中文称为聚合酶链式反应，由变性、退火及延伸几步反应组成一个周期,循环进行,可使目的DNA得以迅速扩增。由美国PE公司遗传部的Dr.Mullis发明，由于PCR技术的跨时代意义，Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。,PCR的原理,变性：双链DNA在高温下解开成单链的过程。温度一般为95左右。,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,加热,PCR的原理,退火：温度下降后，两条配对的单链DNA重新结合
3、为双链的过程。温度一般为5060。,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC,GGACTCGACACT,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC,GGACTCGACACT,降温,PCR的原理,延伸：DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。温度一般为72左右。,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC,
4、GGACTCGACACT,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA,GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT,恒温,普通PCR的原理,普通PCR的原理,PCR反应成分：1.模板DNA 2.引物 3.四种脱氧核糖核苷酸 4.DNA聚合酶(Taq酶)5.反应缓冲液、Mg2+等 6.荧光探针（荧光定量PCR）,Taq酶的发现,在Taq酶发现之前，实验室的PCR反应中运用的是大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段。Klenow酶不耐高温，90加热后会变性失活，每次循环结束
5、都要加入新鲜的酶。而且DNA的延伸是在37完成，模板和引物容易错配，造成反应的特异性很差。,Taq酶的发现,美国的嗜热菌研究室在黄石国家公园温泉中发现了嗜热菌(Thermus aquaticus)株，Cetus公司研究人员从中分离了Taq DNA聚合酶特点：耐高温：70 2h 活性90%，93 2h 活性60%，95 2h 活性40%；延伸温度较高(一般为72)：大大提高了扩增特异性、灵敏性和扩增效率。,荧光定量PCR,概念：在PCR反应中加入荧光基团，利用荧光信号累积或变化实时监测整个反应过程，最后通过特定数学模型对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Appl
6、ied Biosystems，ABI公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。,实时荧光定量PCR的原理,利用荧光信号的变化实时监测PCR反应的每个循环的扩增产物量的变化。通过Ct值和标准曲线分析对起始标本的模板量进行定量分析。,与普通PCR的比较,普通PCR完成后，一般只对扩增的最终产物量进行分析，分析结果多为定性或者半定量结果。荧光定量PCR通过监测荧光值的变化，体现每一个循环的扩增产物量的变化，分析结果为定量结果。,与普通PCR的比较,普通PCR完成后，才能进行扩增产物的分析，而且分析的过程可能产生一定的生物危害和环境污染。荧光定量PCR的扩增和产物分析过程是同时完成的，而且在封闭的反应
7、体系中进行，比较安全，易于处理。,常用的名词概念,本底信号（Baseline）荧光阈值（Threshold）Ct值（Ct value）扩增曲线,前15个循环荧光信号的均值，可手动调节选择,默认是第315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，也可手动调节,扩增过程中，产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数,常用的名词概念,Threshold,Baseline,Ct value,荧光强度Rn,扩增循环数,对数增长期,实际中的运用,左图为5个数量级的标准品扩增后得到的荧光曲线，右图以Ct值为纵坐标，lgXs为横坐标，可计算得出标准曲线,实时荧光定量PCR的分类,目前的实时荧光定量PCR均是基
8、于荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的原理。,荧光共振能量转移（FRET）发生的条件,荧光基团和淬灭基团都能发射荧光荧光基团的发射光谱和淬灭基团的激发光谱需有效重叠荧光基团和淬灭基团应足够的近（10nm）,波长,信号强度,常见的实时荧光定量PCR,TaqMan探针法实时荧光定量PCR分子信标探针法实时荧光定量PCR双链DNA交联荧光染料法实时荧光定量PCR双杂交探针法实时荧光定量PCR蝎形探针法实时荧光定量PCR,探针的荧光标记,探针在其5端标记一个荧光基团，如6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、六氯
9、-6-羧基荧光素(HEX)等探针在其3端标记一个淬灭基团，如6-羧基-四甲基罗丹明(TAMRA),TaqMan探针法实时荧光定量PCR,引物延伸所用到的DNA聚合酶Taq酶同时具有53方向核酸聚合酶活性，还具有对聚合延伸中遇到与靶序列结合的核苷酸序列的53核酸外切酶活性。,分子信标探针法实时荧光定量PCR,茎环结构的分子信标探针,荧光染料法实时荧光定量PCR,最常用的染料就是SYBR Green，游离时只发出微弱荧光，当它非特异性与双链DNA小沟结合后，荧光强度可增大1000倍。所以，反应中发出的荧光信号与扩增产生的DNA双链的量成正比。,几种方法的比较,荧光定量PCR在临床的应用,在实际的临
10、床应用中，TaqMan法的荧光定量PCR比较多见。TaqMan法特异性高，重复性好，价格适中，可以满足临床上检测特定项目的要求。,荧光定量PCR在临床的应用,常见的异常结果：假阳性、假阴性和“灰区”如何发现异常结果：设定阳性对照、阳性质控（低值、中值、高值）和阴性对照加入内标试剂与标本一起扩增，帮助判断假阴性结果出现,荧光定量PCR在临床的应用,如何判断：标本结果为阴性，而内标荧光不随着扩增而增加，则可判断为假阴性结果,荧光定量PCR在临床的应用,出现异常结果的原因：试剂和实验器材的原因：试剂过期失效，耗材中存在DNase、RNase、抑制物等 实验操作不当 标本间污染：相临的测试孔结果相近
11、气溶胶污染：大范围的阳性结果 仪器故障,荧光定量PCR在临床的应用,有效防止和消除气溶胶污染的方法：保持实验室的通风，最好有机械通风设备 10%次氯酸钠溶液的喷洒和擦拭 1M HCl溶液的浸泡 紫外线的照射：500bp片段敏感 75%或无水乙醇溶液喷雾,荧光定量PCR在临床的应用,在反应体系中使用dUTP和UNG酶消除以往实验的污染影响 UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）：选择性水解断裂含有dU的双链和单链中的尿嘧啶糖苷键，在碱性介质和高温下会进一步水解断裂，酶的最佳活性温度是50，在95 失活。,荧光定量PCR在临床的应用,气溶胶污染物,加入UNG酶,荧光定量PCR在临床的应用,5CCACTG
12、CCTCTC CCTGAGCTGTGA3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,扩增,加入dUTP,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3,5CCACUGCCUCUC CCUG
13、AGCUGUGA3,潜在气溶胶污染物,502min,加入UNG酶,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,5断裂的核苷酸片段3,荧光定量PCR在临床的应用,乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)EB病毒DNA(EBV-DNA)人巨细胞病毒DNA(HCMV-DNA)肺炎支原体DNA(MP-DNA)肺炎衣原体DNA(CP-DNA),临床标本的采集,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,用于器官移植、骨髓移植及HIV阳性/AIDS患者人巨细胞病毒感染的辅
14、助诊断和疗效监控。临床上可以采用的标本类型：尿液、乳汁、血清、血浆或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒DNA。,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,巨细胞病毒DNA的提取（血清或血浆）,100l血清或血浆,100l DNA浓缩液,去除上清液，保留沉淀,12000rpm，10min,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,巨细胞病毒DNA的提取（血清或血浆）,加入50lDNA提取液,剧烈振荡混匀5-10s,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,巨细胞病毒DNA的提取（血清或血浆）,振荡混匀510s,12000rpm，5min,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,巨细胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）,1ml尿液或乳汁,去除上清液，保留
15、沉淀,12000rpm，5min,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,巨细胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）,加入50lDNA提取液,剧烈振荡混匀5-10s,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,巨细胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）,振荡混匀510s,12000rpm，5min,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）,1ml抗凝全血,1ml生理盐水,0.3ml淋巴细胞分离液,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）,水平离心机2500rpm，15min,淋巴细胞层,吸取淋巴细胞悬液,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细
16、胞的提取）,淋巴细胞悬液,去除上清液，保留沉淀,12000rpm，5min,人巨细胞病毒DNA定量检测试剂盒,人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）,加入50lDNA提取液,剧烈振荡混匀5-10s,人巨细胞病毒DNA检测试剂盒,人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）,振荡混匀510s,12000rpm，5min,荧光定量PCR扩增过程,50,94,2min,5min,93,15s,57,30s,Stage1,Stage2,Stage3,25,1min,Stage4,DNA浓缩液的作用,DNA浓缩液的成分：PEG6000、NaClPEG（聚乙二醇）的作用：PEG与自由水分子结合，同时蛋白
17、质表面的水化膜被夺走，与水分子结合的极性集团转而与多聚物的氧原子或者氢氧根结合，形成蛋白质与多聚物的复合体，从溶液中沉淀析出。提高低浓度标本的检出率。PEG的浓度与沉淀出的DNA片段大小成反比。,DNA浓缩液的作用,NaCl的作用：在细胞内DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白DNP，而RNA与蛋白质结合成为核糖核蛋白RNP,在不同盐浓度中二者溶解度不一样。DNP在纯水或者12M的Nacl溶解度较大，在0.14M溶解度较低，而0.14M中RNP溶解度较大，因此利用0.14M可分离RNP和DNP。,DNA提取液的作用,DNA提取液的主要成分：NP-40 TritonX-100 Chelex-100
18、EDTA(pH8.0)Tris-HCl(pH 8.0)NaOH,（乙基苯基聚乙二醇）很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱,（聚乙二醇辛基苯基醚）一种非离子性去垢剂，被用来做细胞破膜剂/细胞通透剂,（聚苯乙烯二乙烯基苯）提取DNA过程中，Chelex100能有效除去非核酸有机物,螯合Mg、Ca等二价金属离子，抑制依赖金属离子的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用,（三羟甲基氨基甲烷）与盐酸按比例混合后形成的一种缓冲液体系，DNA在这一体系中呈稳定态,核酸在pH 59是稳定的，pH12/3会引起双链之间氢键解离而变性,淋巴细胞分离液的作用,人外周血中各种细胞的密度不同，红细胞为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.0740.001。淋巴细胞分离液密度为1.0771.080g/ml，密度梯度离心法原理是根据各类血细胞比重的差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液进行离心，使血细胞按照相应的密度梯度分布于不同的位置，从而达到分离的效果。,？问？题？,PCR的中文名称，一般包括哪几个反应过程？在PCR中我们常用到的酶是什么？有什么优点？荧光共振能量转移的原理？有效防止和消除气溶胶污染的方法？在临床血液标本采集中哪种抗凝剂不能使用？淋巴细胞分离液的作用原理？,
