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1、实验四,蛋白质的颜色反应 和沉淀反应,一、实验目的,1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应2.了解蛋白质的沉淀反应、颜色反应的机理。,二、实验原理,蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。,（一）蛋白质的颜色反应原理,（二）蛋白质的沉淀反应原理,蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如-NH3+，-COO-，-SH等和水有高度亲和性，
2、当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。,蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。,蛋白质变性后,有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷),并不析出.因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀,而沉淀的
3、蛋白质也未必都已变性.,三、实验仪器、试剂和材料,1.卵清蛋白液：将鸡蛋白用蒸馏水稀释2040倍，23层纱布过滤，滤液冷藏备用。2.饱和硫酸铵溶液：称硫酸铵850g 加于1000mL 蒸馏水中，在7080下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。3.1%醋酸铅溶液4.1%硫酸铜溶液5.0.1%茚三酮溶液：0.1g 茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。6.浓硝酸：比重1.42。7.试管及试管架、吸管、量筒等。,四、操作步骤,(一)蛋白质的颜色反应,1.双缩脲反应,原理：当尿素经加热至180左右时，两分子尿素脱去一分子氨，进而缩合成一分子双缩脲。在碱性条件下双缩脲
4、与铜离子结合成红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。多肽及蛋白质分子结构中均含有许多肽键，其结构与双缩脲分子中的亚酰胺键相同。因此，在碱性条件下与铜离子也能呈现出类似于双缩脲的呈色反应。,实验过程,取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化并形成双缩脲，释出的氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH 溶液1mL 混匀，观察有无紫色出现。另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%NaOH 溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。,2.蛋白质的黄色反应,实验原理：含有苯环结构的氨基酸，如酷氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色
5、物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应(苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应)。,实验过程：,在一试管内，加蛋白质溶液10滴及浓硝酸34滴，加热，冷却后再加10%NaOH 溶液5滴，观察颜色反应。,3.茚三酮反应,实验原理：在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。此反应为一切蛋白质和氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物)。含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。,茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮;第二步是所形成
6、的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合成有色物质。,实验过程：,取1mL 蛋白质溶液置于试管中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现(注意：此反应必须在pH57进行)。,(一)蛋白质的沉淀反应,1.盐析作用原理,用大量中性盐(如硫酸铵、硫酸镁、氯化钠等)，使蛋白质沉淀析出的过程，称为蛋白质的盐析作用。它包括两个过程：一是电解质破坏了蛋白质的水化层而出现沉淀；二是电解质中和了蛋白质分子所带的电荷而出现沉淀。中性盐能否沉淀各种蛋白质与中性盐的浓度、蛋白质的种类、溶液的pH值以及蛋白质胶体颗粒大小有关。大颗粒蛋白质胶体比小颗粒更容易沉淀，如球蛋白多在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱
7、和硫酸铵溶液中才能析出。,实验过程,取1支试管加入3mL 蛋白质溶液和3mL 饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约10min，球蛋白则沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直至粉末不再溶解达到饱和为止，析出的沉淀为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。,2.乙醇沉淀反应,原理：在水溶液中，蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒。在有机溶剂中，蛋白质颗粒因失去电荷或脱水而沉淀。,取1支试管架蛋白质溶液1mL，加晶体氯化钠少许(加速沉淀并使沉淀完全)待溶解后再加入95%乙醇2mL 混匀。观察有无沉淀析出。,3.重金属盐沉淀反应,实验原理：蛋白质在碱性溶液中，带有较多的负电荷，当与带正电荷的重金属离子结合时，即生成不溶于水的沉淀。,实验过程,取2支试管各加蛋白质溶液2mL，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内滴加10%硫酸铜溶液，观察沉淀生成。,
