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1、血清学试验,血清学试验,血清学鉴定：用已知抗体鉴定未知的细菌或标本中的抗原血清学诊断：用已知抗原检测血清中的特异性抗体,抗原（antigen）,是一类能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞（免疫原性），并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质（反应原性）。,（一）抗原的性质,抗原的性质,抗原的性质,3.立体化学结构：一般分子结构和空间构象愈复杂的物质，免疫原性愈强。,4.抗原决定族antigenic determinant(抗原分子表面上的具有一定化学组成和结构的特殊化学基团)决定其特异性,2.分子量足够大：一般104道尔顿,抗原决定族,抗原种类,抗原的种类,微生物抗原成分-细菌抗原成
2、分,菌体抗原:革兰氏阴性菌的菌体抗原称O抗原-脂多糖蛋白质的复合物,微生物抗原,鞭毛抗原称为H抗原,表面抗原:不同细菌的表抗原名称不同.大肠杆菌的表面抗原称为封套抗原或K抗原,肺炎双球菌的叫荚膜抗原,伤寒沙门氏菌的表面抗原称为Vi抗原,细菌抗原,细菌的各种抗原,微生物抗原,颗粒抗原组分抗原可溶性抗原,微生物抗原成分-病毒抗原成分,抗体,是由抗原刺激人体或动物体的B细胞,由B细胞转化成浆细胞所产生的具有特异性的免疫球蛋白(immunoglobulin,缩写为Ig),抗体(antigen),抗体种类,Ig：存在于血清（占血清免疫球蛋白总量的80%）和组织液中。,抗体的结构和种类,IgA：二体IgD
3、：IgE：IgM：五体,IgG结构,IgA结构,Ig：存在于血清（占血清免疫球蛋白总量的13%）和外分泌液中,IgM 等结构,Ig：血液中 Ig：血清中，1%Ig：血清中，0.002%,抗体的产生部位,抗体在人体中产生部位,抗体的存在部位:血清、乳汁、体液,抗体作用,抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）,抗原抗体反应,抗原抗体反应（antigen-antibodyreaction）是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（invivo），也可发生于体外(invitro)。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的
4、介质（例如电解质、补体、固相载体等）不同，可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清反应（erologicreaction）。,抗原抗体反应条件,抗原抗体反应条件,抗原抗体,3.环境因素：（1）电介质：0.85%NaCI；（2）温度：37或56（3）pH值：7.0（4）振荡：适当的机械振荡（5）反应时间,抗原抗体反应一般规律,特异性和交叉性 若两种抗原之间含有部分共同抗原时，则发生交叉反应。亲缘关系越近，交叉反应的程度也越高。反应的可逆性 抗原与抗体的结合为分子表面的结合，
5、结合的适宜温度为040、pH在4.09.0范围内。如温度超过60或pH降到3.0以下，或加入解离剂台硫氰化钾、尿素等，则抗原抗体复合物又可重新解离，解离后的抗原或抗体性质不改变。,抗原抗体反应一般规律,最适比和带现象只有抗原与抗体呈适当比例时，才可出现可见的结合反应。当抗原过多或抗体过多，则抗原抗体的结合不能形成大的复合物，因而抑制可见反应的出现，这一现象称为带现象。抗体过多出现的抑制现象称前带现象，而抗原过多出现的抑制现象称后带现象。为了克服带现象，在进行血清学试验时，需将抗原或抗体作适当稀释。,抗原抗体反应一般规律,反应的二阶段性 结合阶段-反应发生快，几秒钟至几分钟。反应阶段-较慢，需几
6、分钟、几十分钟或更长时间。,凝集反应,颗粒性抗原（如细菌、红血球等）或吸附在乳胶、白陶土、离子交换树脂和红细胞的抗原与其特异性抗体结合后，在有电介质存在时，凝聚成肉眼可见的凝集小块。,凝集原凝集素,抗原抗体反应类型-凝集反应,血清凝集试验,间接凝集反应,将可溶性抗原（或抗体）吸附于与免疫无关的小颗粒（载体）表面，加入相应的抗体（或抗原），在适宜条件下，发生凝集反应。,载体：动物的红血球；聚苯乙烯乳胶；矽酸铝；活性炭等。,抗原抗体反应类型-间接凝集反应,间接血凝试验,间接血凝试验吸附抗原的红细胞就称为致敏红细胞。致敏红细胞与相应抗体结合后，能出现红细胞凝集现象。用已知抗原吸附于红细胞上检测未知抗
7、体称为正向间接血凝试验，用已知抗体吸附于红细胞上鉴定未知抗原称为反向间接血凝试验。常用的红细胞有绵羊、家兔、鸡及人的O型红细胞。,抗原抗体反应类型-间接凝集反应,间接血凝抑制试验,间接血凝抑制试验抗体与游离抗原结合后就不能凝集抗原致敏的红细胞，从而使红细胞凝集现象受到抑制，这一试验被称为间接血凝抑制试验。,抗原抗体反应类型-间接凝集反应,乳胶凝集试验,乳胶凝集试验 以乳胶颗粒作为载体的间接凝集试验，称为乳胶凝集试验。该试验既可检测相应的抗体也可鉴定未知的抗原，而且方法简便、快速，在临床诊断中广泛应用于伪狂犬病、流行性乙型脑炎、钩端螺旋体病、猪细小病毒病、猪传染性萎缩性鼻炎、禽衣原体病、山羊传染
8、性胸膜肺炎、囊虫病等的诊断。,抗原抗体反应类型-间接凝集反应,协同凝集试验,协同凝集试验 葡萄球菌A蛋白是大多数金黄色葡萄球菌的特异性表面抗原，能与多种哺乳动物血清中的IgG分子的Fc片段相结合，结合后的IgG仍保持其抗体活性。当这种覆盖着特异性抗体的葡萄球菌与相应抗原结合时，可以相互连接引起协同凝集反应，在玻板上数分钟内即可判定结果(加图图八)。目前已广泛应用于快速鉴定细菌、霉形体和病毒等,抗原抗体反应类型-间接凝集反应,碳粉凝集试验,炭粉凝集试验 以极细的活性炭粉作为载体的间接凝集试验，称为炭粉凝集试验。反应在玻板上或塑料反应盘进行，数分钟后即可判定结果。通常是用抗体致敏炭粉颗粒制成炭素血
9、清，用以检测抗原，如马流产沙门氏菌；也可用抗原致敏炭粉，用以检测抗体，如腺病毒感染、沙门氏菌病、大肠杆菌病、囊虫病等的诊断。,抗原抗体反应类型-间接凝集反应,抗原抗体反应类型-沉淀反应（precipitation reaction),可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等）与相应的抗体结合，在适量电介质存在下，形成肉眼可见的细微的白色沉淀。,抗原抗体反应类型-沉淀反应（precipitation reaction),可溶性抗原+相应抗体 肉眼可见的沉淀,沉淀反应,环状沉淀反应,絮状沉淀反应,抗原抗体反应类型-沉淀反应,常用于毒素、类毒素和抗毒素的定
10、量测定,主要用于抗原的定性试验，如炭疽病的诊断（Ascoli氏试验）、链球菌的血清型鉴定和血迹鉴定等,沉淀反应,沉淀反应-凝胶扩散试验：1%琼脂凝胶的孔径约85毫微米，可允许各种抗原抗体自由扩散。由近及远形成浓度梯度。,单向单扩散,单向双扩散,抗原,抗血清+琼脂,抗原,琼脂,抗血清+琼脂,沉淀反应,沉淀反应-琼脂扩散试验：,双向单扩散,双向双扩散,抗血清+琼脂,抗原,沉淀线,孔径3mm,抗原,待检血清,标准阳性抗血清,单向免疫扩散,A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab；C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab；D：扩散率近似，浓度Ag Ab；E：浓度Ag A
11、b，扩散率Ag Ab；F：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab,沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系,双向琼脂扩散,(1)沉淀线吻合：待检抗原与标准抗原完全相同。(2)沉淀线相切：待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。(3)沉淀线相交：待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。(4)沉淀线部分吻合：待测抗原和标准抗原性质相同，但含量较低。,A1：待检抗原；A2：标准抗原,双响琼脂扩散,抗体效价滴定,用梅花型孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的效价。,对流免疫电泳,在pH为8.6的琼脂凝胶板上打孔，两孔为一组
12、，孔径3mm，抗原、抗体孔间距为45mm。将抗原加入负极端孔内，抗体加入正极端孔内，用24mA/cm电流电泳1h左右，观察结果，在两孔之间出现沉淀带的为阳性反应。,在pH8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白因等电点高，只带有微弱的负电荷，而且分子又较大，因此电泳力小，小于电渗力，泳向负极；而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子较小，电泳力大，大于电渗力，泳向正极，电泳时抗原放负极侧，抗体放正极侧，抗原抗体相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇，在比例适当处形成肉眼可见的沉淀线。,对流免疫电泳原理,对流免疫电泳结果判定,1为阳性2为弱阳性3/4为强阳性,对流电泳方法评价,简便、快速、敏感度较双
13、向琼脂扩散试验高810倍，但分辨力低于双向琼脂扩散试验。,火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis,RIE),火箭免疫电泳,火箭免疫电泳是单向单扩散和电泳技术相结合的一种血清学试验。是让抗原在电场的作用下，在含有抗体的琼脂中定向泳动，二者比例合适时形成类似火箭样的沉淀峰。沉淀峰的高度与抗原的浓度成正比。,火箭免疫操作步骤,1.制备抗体琼脂糖凝胶板 将已融化的1.2%巴比妥缓冲琼脂糖冷却至55左右，加入适量抗血清，混匀后立即浇板，置室温凝固。2.打孔 在琼脂凝胶板一侧打孔，孔径3mm，孔距2mm。置琼脂板于电泳槽内，搭桥后用微量注射器准确加样10l。3.电泳 样品孔
14、放负极侧，电压810V/cm或电流35mA/cm，电泳6h。4.观察沉淀峰 电泳完毕后，观察琼脂板上沉淀峰，并测量从孔中心到峰尖的高度。5.绘制标准曲线图 以峰高为纵坐标，浓度为横坐标(对数坐标)，绘制标准曲线，求出待检样品内抗原浓度,火箭免疫结果,若抗原与抗体比例合适，则孔前出现顶端完全闭合的火箭状沉淀峰；抗原大量过剩时或不形成沉淀峰，或沉淀峰不闭合；抗原中等过剩时沉淀峰呈圆形；当二者比例不适当时，常不能形成火箭状沉淀峰。,火箭免疫电泳方法评价,火箭电泳是一种操作简便、省时、结果重复性好的定量检测方法。其敏感度可测0.3mg/L抗原含量，若低于此水平则难以形成可见的沉淀峰。如加入少量125I
15、标记的抗原在含抗体的琼脂板上电泳，形成的不可见火箭峰，经洗涤干燥后，用X线胶片感光，经显影和定影，可呈现同位素显影，这就是放射自显影技术，可用于微量抗原含量测定，如测定血清AFP或IgE含量，可测至g/L水平。,免疫电泳(immunoelectrophoresis,IEP),是将区带电泳和双向琼脂扩散相结合的一种免疫化学分析技术。,免疫电泳示意图,免疫电泳操作步骤,1.取洁净载玻片，浇注融化的琼脂凝胶，凝固后打孔挖槽。2.用微量加样器加待检标本或正常血清对照于孔内。3.电泳条件以电压46V/cm或电流23mA/cm为宜，电泳1.52h。4.电泳完毕后，用毛细滴管在槽内加入含相应抗原，孵育，使抗
16、原抗体双相扩散，形成沉淀线。5.观察沉淀线的数目、形状和位置。经漂洗、干燥、染色、脱色等步骤制作染色标本，可长期保存。例如血浆蛋白免疫电泳。,免疫电泳方法评价,免疫电泳分辨率高，可分出人血清中2030种抗原成分，可鉴定混合抗原中各组分。,补体结合反应,补体特点：补体可与任何抗原抗体复合物结合，但不能单独与抗原或抗体结合。在有特异抗体存在时可以溶解细胞（溶菌或溶血）。,抗原抗体反应类型-补体结合反应,有补体参加的抗原抗体反应。,补体结合反应,指示系统：,反应系统：,补体结合反应,标记抗原抗体反应,可用放射性同位素、荧光素或酶等标记抗原或抗体。,抗原抗体反应类型-标记抗原抗体反应,免疫荧光技术,是
17、用荧光色素对抗体或抗原进行标记，再与相应抗原或抗体结合，然后在荧光显微镜下观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。常用的荧光色素有异硫氰酸荧光素（FITC），此外还有四乙基罗丹明（RB200）、四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）和三氯三嗪基氨基荧光素（DTAF）等。,免疫荧光法,荧光标记法,直接免疫荧光法,间接免疫荧光法,酶标记抗体技术（免疫酶技术）,是利用抗原抗体的特异性结合和酶的高效特异的催化作用显色而建立起来的免疫检测技术。常用的标记酶是辣根过氧化物酶（HRP），其作用底物为过氧化氢，催化时需要供氢体，常用的供氢体有3，3-二氨基联苯胺（DAB）和邻苯二胺（OPD），前者反应后形成不
18、溶性的棕色物质，适用于免疫酶组化法；后者反应后形成可溶性的橙色产物，敏感性高，易被酸终止反应，呈现的颜色可数小时不变，是ELISA中常用的供氢体。,酶标记抗体技术（免疫酶技术）,直接法 用酶标记抗体直接处理含待检抗原的标本，洗涤后浸于含有过氧化氢和DAB的显色反应液中作用，然后在普通光学显微镜下观察颜色反应，抗原所在部位呈棕黄色。间接法 含待检抗原的标本先用未标记的抗血清处理，洗涤后再用相应的酶标记抗抗体处理，洗涤，然后浸于含有过氧化氢和DAB的显色反应液中作用，普通光学显微镜下观察颜色反应，以指示是否有抗原-抗体-抗抗体复合物存在。,酶联免疫吸附试验（简称ELISA）,将抗原或抗体吸附于固相
19、载体的表面，酶标记物与相应的抗体或抗原反应后，形成酶标记抗原抗体复合物，在遇到相应底物时，结合物上的酶催化底物产生水解、氧化或还原等反应，从而生成可溶性或不溶性的有色物质，可用肉眼或酶标测定仪判定结果。颜色的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，因此，可根据颜色的深浅来定量抗体或抗原。,直接法,将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附的抗原，加入一定量的酶标记抗体与样品(含有抗原)提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体-酶复合物。洗除多余部分，加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解应，产生有色物质。通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。,间接法,将已
20、知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗抗体，与吸附在固体表面的抗原-抗体复合物相结合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。,斑点酶联免疫吸附试验,以纤维素薄膜为固相载体，在膜上进行免疫酶反应。先将抗原或抗体吸附在纤维素膜的表面，通过相应的抗体或抗原和酶标记物的一系列反应，形成酶标记抗原抗体复合物，加入底物后，结合物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一种带色物质，沉着于抗
21、原抗体复合物吸附部位，呈现出肉眼可见的颜色斑点，试验结果可通过颜色斑点的出现与否和色泽深浅进行判定。,免疫转印技术(immuno-blot),1979年Towbin将核酸转印技术（Southern blot）应用于蛋白质研究，建立了蛋白质转印技术（Western blot）。免疫转印技术的基本原理是将凝胶电泳与固相免疫测定结合起来，将经电泳分区的蛋白质精确且近似定量地转移到固相载体上如硝酸纤维素膜(NC膜)，并保持其原有的生物活性，再经荧光免疫、酶免疫、放射免疫技术等进行测定，可得以定位、定性和定量结果。实质上分3步骤即蛋白质组分分离、各组分转印及免疫检测。,免疫转印技术操作步骤,1.蛋白质分
22、离 采用聚丙稀酰胺凝胶电泳(polyacryamide gel electrophoresis,PAGE)进行分离。2.蛋白质转印 从凝胶上将蛋白质转移至NC膜 等固相载体的过程即为蛋白质转印。3.蛋白质的免疫检测 将已转印NC膜封闭，用酶免疫组化技术、免疫金组化技术等检测。,免疫转印技术方法评价,免疫转印技术综合了PAGE的高分辨力和免疫标记技术的高度特异性和敏感性。PAGE具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应，使之具有高度的分辨力，在同一固相载体上可作多项成分的分析。,中和试验,病毒或毒素与相应抗体结合后，丧失了对易感动物、鸡胚和易感细胞的致病力，称为中和试验。,中和试验,中和试验,Thanks,
