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1、第四章 遗传多样性及其保护,内容提要 遗传多样性是种上水平各类多样性来源的重要基础，也是保护生物学研究的核心内容和热点问题，遗传多样性的保护是目前保护生物学的主要任务。本章就遗传多样性的概念、表现形式，各水平遗传多样性的来源和检测方法，遗传多样性的研究意义进行了论述。,通常包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性三个组成部分。,遗传多样性是物种多样性和生态系统多样性的前提和条件。一方面，任何一个物种都具有其独特的基因库和遗传组织形式，物种的多样性也就显示了遗传多样性；另一方面，物种是构成生物群落进而组成生态系统的基本单元，生态系统的多样性离不开物种的多样性，也就离不开物种所具有的遗传多样性,
2、对生物遗传多样性的研究所具有重要的理论和实际意义，它不仅在于可揭示物种的起源与进化历史，为动植物的分类、进化研究提供有力的证据，而且可为保护区规划、遗传资源的保存及动植物的育种和遗传改良等工作提供理论依据。,第一节 遗传多样性的概念及研究意义,广义-地球上生物所携带的各种遗传信息的总和。通常谈及生态系统多样性或物种多样性时也就包含了各自的遗传多样性。,狭义-生物种内基因的变化，包括种内显著不同的种群之间以及同一种群内的遗传变异（世界资源研究所，1992）,遗传多样性是生物适应环境能力的体现,是生命进化和物种分化的基础。,一、遗传多样性的概念,遗传多样性的含义:,遗传多样性是指生物种内的遗传变异
3、；遗传多样性是指种内可遗传的变异；遗传多样性的本质是生物体在遗传物质上的变异，即编码遗传信息的核酸（DNA或RNA）在组成和结构上的变异；遗传多样性的表现是多层次的。,二、遗传多样性的内涵,遗传多样性,遗传变异的高低,遗传变异的分布格局,种内多样性是物种以上各水平多样性的重要来源。遗传变异、生活史特点、种群动态及其遗传结构等决定或影响着一个物种与其它物种及其环境相互作用的方式。而且，种内的多样性是一个物种对人为干扰进行成功反应的决定因素。种内的遗传变异程度也决定其进化的潜势（Solbrig 1991）。,遗传多样性的含义:,遗传多样性是指生物种内的遗传变异；遗传多样性是指种内可遗传的变异；遗传
4、多样性的本质是生物体在遗传物质上的变异，即编码遗传信息的核酸（DNA或RNA）在组成和结构上的变异；遗传多样性的表现是多层次的。可以表现在外部形态上 如豌豆的花色、果蝇的翅型；表现在生理代谢上，如植物光合作用的强弱、酶活性的高低等；也可表现在染色体、DNA 分子等水平上。,三、遗传多样性的表现形式,不同亚种的狗,不同基因的玉米,种内的遗传变异通常可分成以下四个类型：1.局部群体内的变异；2.生活在相似气候和土壤条件下隔离群体间的变异；3.生长在不同环境条件下、产生独特生态型的群体间的变异；4.分类学上亚种间的变异。,遗传多样性可以表现在：1 表型水平上的个体外部形态上的差异 如豌豆种皮的颜色、
5、鸡冠的形状、人类的肤色等。2 表现在细胞水平上的染色体倍性、数目、核型及带型的差异 如多倍体、单体、三体等。3 生理、生化水平上 如光合作用的途径和强弱、酶活性的高低以及等位酶谱带的差异。4 分子水平上的DNA序列的变化,注：1.遗传多样性通过对上述各层次的生物性状的影响，导致生物体的不同适应性，进而影响生物的分布和演化。2.许多遗传变异并不导致任何可观测到的表型上的差异。,物种的遗传变异愈丰富，对环境适应性就愈广，也就是说群体内的遗传多样性性反映了物种的进化潜力。,四 遗传多样性的研究意义,新的变异是遗传变化累计的结果，这些变异必须经受自然选择的筛选，一些中性突变和“有利”突变通过自然选择而
6、保留下来。,遗传多样性研究的理论和实际意义：,1.可以揭示物种或种群的进化历史，也能为进一步分析其进 化潜力和未来命运提供重要的资料。,2.探讨物种的濒危机制，制定科学合理的保护策略，防止近交衰退等了解种内遗传变异的大小、时空分布及其与环境条件的关系，是我们制定科学有效的措施来保护人类赖以生存的遗传资源（基因），来挽救濒于灭绝的物种的重要依据。,通常必须考虑的三个主要因素：每个种群采集的个体或种子数；取样种群的数目；这些取样种群在该物种分布区内的分布。当我们对取样缺乏足够的知识时，通常以尽可能多取一些种群为好，取样种群的选择要根据物种的分布式样和环境异质性而定。另外，取样策略还与取样的目的有关
7、，是为了遗传多样性的保护和可持续利用，还是为了进行某一方向的研究；是考虑整个物种，还是考虑该物种在特定区域的种群之间或者是种群内的遗传多样性等。,3.种质资源的保存及取样策略,第二节 遗传多样性的来源,遗传和变异是生物的主要特征之一。没有遗传，物种就不能保持性状的相对稳定，变异不可能得到积累，也不可能产生多样性。但是，物种的稳定性是相对的，没有变异，仅凭遗传带来的简单重复，就不可能有新的性状和物种的产生，生物就失去了进化的动力和原材料。,种内遗传变异的来源主要有重组、染色体畸变和突变。新的变异可以看作是变异积累的结果，在自然选择的背景下,大量的与环境不适应和有严重缺陷的突变体被选择淘汰出群体，
8、而那些对选择有益的突变，则由于能够增加有机体生存和繁殖的能力而被得以积累和保留。,基因存在于脱氧核糖核酸,突变、畸变,杂交、重组,DNADNADNADNA,自然选择,种群 1 DNA DNA DNA,种群2 DNA DNA,种群 3 DNA,1.遗传重组（genetic recombination）重组即通过有性过程将群体中不同个体具有的变异进行重新组合，形成新的变异。在有性生殖的生物中，由不同合子发育成的个体不可能有相同的基因型，其根本原因就在于重组。细胞减数分裂时非同源染色体的独立分配和自由组合是一种基本的重组过程。体细胞减数分裂产生配子，配子融合导致遗传物质的重新组合。,1)一般重组：同
9、源DNA分子之间的重组；2)位点专一重组：发生在顺序极少同源的DNA分子间；3)异常重组：顺序不同源的DNA分子间。,2.染色体畸变（chromosomal aberration）染色体结构或者数目的改变,缺失(deletion)重复(duplication)染色体结构的变化 倒位(inversion)易位(translocation),整倍体变异：染色体数目的变化以染色体组为单位而增减；染色体数目的变化 非整倍体变异：细胞核内染色体是染色体组的完整倍数，而是在二倍体 染色体数目的基础上增减；,为保持物种遗传的稳定性，生物体或细胞自身具有各种对DNA修复机制，因此，生物个体在正常生活环境中每个
10、基因位点的自发突变率很低。但由于一个物种拥有许多个体，每个个体又具有许多基因位点，所以新的基因突变能在自然界不断地出现。此外，基因流（gene flow）、杂交（hybridization）、选择（selection）和遗传漂变（genetic drift）等也会造成群体之间出现各种不同形式的分化和隔离，也是产生种内遗传变异的因素，形成种内不同的遗传变异分布格局，即特定的群体遗传结构。,第三节 遗传多样性的检测方法,遗传多样性的检测最初是从形态学开始的。本世纪60年代，酶电泳技术以及循异性组织化学染色法应用于群体遗传和进化研究，使科学家们从分子水平来客观地提示遗传多样性成为可能，并极大地推动了
11、该领域的发展（Hubby等，1996；Ayala等，1984）进入80年代，分子生物学和分子克隆技术的发展带来了一系列更为直接的检测遗传多样性的方法，即直接测定遗传物质本身DNA序列的变异（Hillis等，1990；Avise，1994）。,检测遗传多样性的方法随生物学，尤其是遗传学和分子生物学的发展而不断提高和完善，从形态学水平、细胞学（染色体）水平、生理生化水平逐渐发展到分子水平。,研究者针对遗传多样性的四种不同表现形式，发展了：形态标记；细胞学标记；生理、生化标记；DNA分子标记的遗传多样性检测技术，可以从不同角度和层次来揭示物种的遗传变异。,一、形态标记,表型性状的变异通常是由物种的遗
12、传起源、自然选择压力和人工选育目的不同形成的。对形态性状变异的度量、描述和分析可以分为以下几个步骤：1 性状的选择；2 确定性状变异的遗传基础；3 遗传变异的度量和分析。,1 性状的选择,基因型,表达,蛋白质,个体发育,表现型,调控,人们对遗传多样性的检测最初是从形态学开始的。,性状选取是在表型水平上研究遗传变异性的第一步，因为任何生物体都存在成千上万甚至无数的表型性状，故要对所有的性状都进行深入研究是不可能的。人们研究目的不同，性状选取的标准也不尽相同。如果研究生物适应和进化的机制，就要选取尽可能多的性状，尤其要重视那些具有较大进化意义的性状，如生活史性状（出生、死亡等）。而针对那些具有重要
13、经济价值的动植物类群来说，人们更关心的是与国民经济密切相关的经济性状，如猪的产仔数、牛的产乳量、作物的产量及抗性等等。,2 确定性状变异的遗传基础,3 遗传变异的度量和分析,对于选定的性状，通常采用长度、高度、角度、重量以及配合解剖镜、显微镜对一些细微结构的观测，取得性状在个体和群体间的变异数据。结合多元统计分析方法，揭示橙红性状受遗传控制的大小，进而估计群体遗传变异的大小和遗传结构。,由于天然群体中单基因控制的性状很少，我们目前能够准确分析的基因位点数量还不多。所以，仅凭形态学资料我们还很难全面、准确的估计生物的遗传变异性，这也是利用形态学性状研究遗传多样性中存在的缺陷。,关键：,表型性状差
14、异,基因型差异,表型形状,符合孟德尔遗传规律的单基因性状,多基因决定的数量性状,二 细胞学标记,细胞学标记主要是指利用生物体核型和带型的差异，确定物种遗传变异的类型及分布（又称染色体标记）。主要用于检测染色体的数目和结构的变异。,1 染色体数目的变异,染色体是遗传物质的载体，是基因的携带者，染色体变异必然导致遗传变异的发生，是生物遗传变异的重要来源。,染色体变异,染色体数目（整倍或非整倍性）,染色体结构（倒位、缺失、重复、易位）,染色体数目异常的主要原因在于生殖细胞分裂过程中出现了染色体的行为异常。,核型（Karyotype）：体细胞染色体在光学显微镜下所有可测定的表型特征的总称。核型分析：对
15、核型的各种特征进行定量和定性的描述。,植物中一些典型的种内染色体数目变异,物种 染色体数目变异,Artemisia douglasiana 18 34 54Fraxinus chinensis 46 92 138Najas guadalupensis 12 36 42 48 54 60Sedum wrightii 24 48 72 96,非整倍性变异,Cardamine pratensis 16 24 28 30 32 38 40 42 56 60 64 73Charenactis douglasii 12 13 14 15 18 24 25 26 27 28 36 38Ottelia ali
16、smoides 22 28 38 40 42 44 50 52 55 56 60 64,2 染色体结构变异,G-带(giemsa binding)、C-带(constitutive heterochromatin banding)、R-带(revetse banding)、N-带(nucleolar organizer region banding)等,和染色体数目的多态相比，染色体结构变异在种内更为常见。但结构变异不象数目变异那样容易观察和分析。,加洲Sierra Nevada 山不同海拔高度上D.pseudoobscura种群第三染色体上不同倒位类型的频率,倒位类型频率（%）,ST AR
17、CH 其它,海拔（英尺）,850 46 25 16 133000 41 35 14 104600 32 37 19 126200 26 44 16 148000 14 45 27 148600 11 55 22 12,三 生化标记,1、等位酶,等位酶（Allozyme）:同一基因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同形式叫做“等位酶”，它是借助于特定的遗传分析方法确定的一种特殊的同工酶。,利用酶蛋白携带电荷的多寡以及分子质量大小的差异，应用电泳的方法将之分离，并通过适当的染色技术显现不同的酶的谱带。,同工酶（Isozyme）：生物有机体产生的催化同一种反应但具有不同分子形式的酶。,水平切片淀粉
18、凝胶电泳等位酶分析的基本步骤,等位酶方法不仅能定量地估计遗传变异水平的高低，还可以有效地度量种群地遗传结构，即遗传变异在种群中的分布。,不同的种群遗传结构是各种进化因素共同作用的结果，决定了物种保护应采取什么样的策略和措施。,对植物中利用等位酶研究遗传变异的653篇研究结果进行了比较，分析了等位酶多样性与物种的系统位置、生活习性、分布地区、分布范围、繁育系统、种子传播方式、生殖模式和演替阶段8个因素之间的关系。,结果：分布地域广、寿命长、基因交流频繁、结实量高以及处于演替阶段末期群落中的物种具有较高的遗传变异水平，而影响种群遗传结构的最重要因素是繁育系统和基因交流程度。,目前，等位酶主要应用于
19、动植物种群遗传结构的研究，其重要的指标有：1 多态位点比例（P）；2 期望杂合度He）.,P：表示多态位点（有2各以上等位基因的位点）在总位点中所 占的比率。He：在满足遗传平衡的条件下，每个个体带有杂合位点的比例,四、DNA分子标记,DNA分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。与前面的3种遗传标记相比，DNA分子标记具有如下优点：直接以DNA的形式表现，不受环境、季节及个体发育状况等其它因素的影响；多态性高，几乎遍及整个基因组；表现为中性标记，既不影响目标性状的表达，又与不良性状无必然的连锁；大多数分子标记表现为共显性(Codominance)，能有效鉴别出纯合基因型和杂合基因型，从而
20、提供系统完整的遗传信息；样品来源广泛，部分分子标记甚至还可以分析微量DNA和古化石样品。,目前DNA分析技术主要是针对部分DNA进行的从原理上可大致分为两类：1 直接测序，主要是分析一些特定基因或DNA片段的核酸序 列，度量这些片段DNA的变异性。2 检测基因组的特定识别位点，估测基因组中的变异性常用方法：RFLP（mtDNA,cpDNA）；RAPD；ISSR；SSR；,RFLP(restriction fragment length polymorphism)是80年代发展起来的基于DNA多态的分子标记技术。该技术是利用限制性内切酶酶解不同生物体的DNA分子后，用特异探针进行Southern
21、杂交，通过放射自显影来揭示DNA的多态性。,(一)DNA限制性片段长度多态性分析(RFLP),RFLP标记的实验流程RFLP实验包括以下六个主要步骤：（1）基因组DNA的制备：RFLP标记对DNA的需要量较大，质量要求较高(大于50kb)，因此，DNA提取过程中要防止模板的降解。（2）基因组DNA的酶解：根据研究目的和材料的特点，选用不同的限制性内切酶或酶的组合，酶切基因组DNA，酶切反应一定要彻底。（3）电泳检测酶切的效果。,（4）Southern转移：用吸印技术或电转移、真空转移技术将琼脂糖凝胶电泳板上的DNA转移至尼龙膜上。（5）分子杂交（6）显影检测,优点：RFLP标记为共显性遗传标记
22、分析的DNA片段相对较大，基因数目多结果具有很强的重复性和准确度,局限性：RFLP标记要求的DNA数量大，质量高并非所有的遗传变异都能检测到技术要求高，步骤繁琐，费用很高,酶切长度多态性（RFLP）优点及其局限性：,（二）随机扩增多态DNA分析技术（RAPD）1990年分别由Williams和Welsh领导的两个研究小组同时提出了随机引物扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA RAPD)技术。,原理：随机排列的核苷酸单链为引物，对生物基因组DNA进行随即扩增，扩增产物片段的多态性反映了基因组响应区域的DNA多态性。技术特点：引物设计是随机的，并且
23、短绝大多数的RAPD标记为孟德尔式遗传操作简单，费用较低,RAPD技术的局限性,1.随机性2.显性标记3.共迁移问题扩增产物的重复性和稳定性较差。,（三）简单重复序列间DNA多态分析技术（ISSR）ISSR（inter simple sequence repeat）技术是一种在微卫星技术上发展起来的、以PCR技术为基础的分子标记技术。,ISSR 标记的实验流程（1）DNA制备；（2）ISSR-PCR反应；（3）凝胶电泳分析；,试验步骤：DNA制备ISSRPCR反应：影响该反应的因素很多，需要预备试验来优化。凝胶电泳分析：琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳,局限性：反应条件需要时间去摸索；显性
24、标记，在解决交配系统、计算杂合度和父系分析方面效果不佳。,（四）微卫星DNA分析技术（SSR）,原理：基因组中大量存在基因外的简单重复序列（simple sequence repeats，SSR；或称微卫星，micro satellite），由于SSR突变率较高，从而会导致核心序列的数目产生变化，产生多态性。,微卫星DNA分析技术（SSR）,试验步骤：DNA模板的提取引物的设计SSR两侧都有物种特异性的侧翼序列；PCR扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳,微卫星DNA分析技术（SSR）,局限性：引物的设计首先要分析SSR两侧的物种特异性序列，费用较高；同时设计出的引物由于特异性高，通用性不强,（五）扩增片段
25、长度多态性（AFLP）分析技术AFLP（amplified fragment length polymorphism）是基于PCR技术的一种新分子标记技术，它既具有RFLP标记的专一性、可靠性、又具有RAPD标记的随机性、方便性，成为目前最具有活力的一种标记技术。,AFLP 标记的实验流程AFLP分析的主要步骤包括模板DNA制备、酶切片段扩增及凝胶电泳分析3个基本步骤。,原理：对基因组的酶切片段进行选择性扩增。首先利用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切；将双链接头连接到DNA片段的末端；以该片段为模板,进行PCR扩增（2次）聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,技术特点：理论上可以产生无限多的AFLP标记；
26、多态性高DNA用量少，检测效率高可靠性好，重复性高对DNA模板质量要求高，对浓度变化不敏感选择上为中性,AFLP检测技术中DNA模板的制备及PCR扩增,（六）DNA 序列分析,物种的遗传多样性在本质上是DNA一级序列的多样性.近年来,随着DNA测序技术的迅速发展和日益普及,DNA测序在遗传多样性的研究中正在起着越来越大的作用。,DNA测序是揭示遗传多样性最理想、最彻底的方法。目前除模式生物及重要物种外，DNA序列分析技术都是针对部分DNA片段：直接测序：分析一些特定的基因或DNA片段检测基因组的一批识别位点来估测基因组的变异性,DNA 的序列分析有两种基本方法，Maxam-Gilbert 化学降解法和 Sanger 氏酶学法。因为测序每个反应读取的序列是有限的，做长片段 DNA 或基因组测序时，需要选用一定的策略。测序的策略有 primer walking，随机测序，定向测序等。现在全自动测序仍然沿用 Sanger 氏酶学法，但是在标记上作了改进。DNA 测序结果通过生物信息学分析，获取需要的信息。,全自动DNA测序仪,思考题：1.遗传多样性概念。2.遗传多样性的表现形式。3.检测遗传多样性的主要方法和原理。4.遗传多样性研究在保护生物学研究中的作用和意义。,
